Princípio:
- O solo é o principal armazenamento dos microorganismos que produzem Antibióticos que são capazes de inibir o crescimento de outros microorganismos. Antibióticos foram implementados em uma ou em outras formas há séculos. A triagem de isolados selvagens do solo produziu a ampla maioria dos novos antibióticos. Mesmo que a purificação de várias centenas de antibióticos produzidos naturalmente tenha sido realizada, apenas alguns se mostraram bem -sucedidos para serem usados na prática médica. Aqueles que atualmente são de maior uso foram derivados de um grupo comparativamente pequeno de microorganismos pertencentes aos gêneros Penicillium, Streptomyces, Cephalosporium, Micomonospora e Bacillus. Nesta época, os esforços contínuos para desenvolver novos antibióticos são as tendências emergentes.
- Mesmo que os solos de várias partes do mundo sejam rastreados continuamente em laboratórios industriais, a fim de isolar novos microorganismos produtores de antibióticos, a microbiologia industrial está direcionando seus esforços para a modificação química das substâncias antibióticas existentes. Isso é concluído adicionando ou substituindo cadeias laterais químicas, reorganizando a ligação intramolecular ou produzindo cepas microbianas mutantes capazes de excretar uma forma mais potente do antibiótico. O estabelecimento de congêneres químicos é responsável pela superação da resistência a antibióticos, reduzindo os efeitos colaterais adversos no hospedeiro e aumentando o espectro efetivo de um determinado antibiótico.
- EU: Usaremos a técnica de placa lotada para o isolamento de microorganismos de produção de antibióticos de duas amostras de solo, uma das quais é semeada com Streptomyces griseus servir como um controle positivo.
- Ii: Para a determinação do espectro antimicrobiano de isolados, os isolados que manifestam atividade antibiótica serão examinados contra vários microorganismos diferentes para estabelecer sua eficácia.
I. Isolamento de microorganismos produtores de antibióticos
Requisitos:
- Suspensões do solo:
- – 1: 500 Diluição da suspensão da amostra do solo (0,1 g de solo por 50 ml de água da torneira) para servir como um desconhecido
- – 1: 500 diluição da amostra de solo semeada com S. Griseus (0,1 g de solo por 50 ml de água da torneira) para servir como controle positivo.
- Mídia:
- Seis tubos profundos de ágar de soja tripticase de 15 ml e duas inclinações de ágar de soja tripticase.
- Equipamento:
-copo de 500 ml
– Tubos de teste
– rack de tubo de ensaio
– Platações estéreis de Petri
– Inocular a agulha
– Placa quente
– Termômetro
-pipetas de 1 ml e 5 ml
– Dispositivo de pipeting mecânico
– Lente da mão de ampliação.
Procedimento para isolamento de microorganismos de produção de antibióticos
- Rotule dois conjuntos de três placas de Petri estéreis com os tipos de amostras de solo sendo usadas e diluições (1: 1000, 1: 2000 e 1: 4000).
- Coloque seis tubos profundos de ágar de soja tripticase em um copo de água e leve para 100 ° C em uma placa quente. Quando o ágar for liquefeito, adicione água fria ao banho de água. Esfriar a forty five ° C, verificando a temperatura com um termômetro.
- Put together uma diluição em série do controle desconhecido e positivo 1: 500 amostras de solo da seguinte forma:
– Rotule três tubos de teste 1, 2 e 3. Com uma pipeta, adicione 5 ml de água da torneira a cada tubo.
-Shake a amostra fornecida de 1: 500 do solo completamente por 5 minutos para efetuar uma suspensão uniforme da água do solo.
-Usando uma pipeta de 5 ml, transfira 5 ml da diluição 1: 500 para o tubo 1 e misture. A diluição closing é 1: 1000.
– Usando outra pipeta, transfira 5 ml do tubo 1 para o tubo 2 e misture. A diluição closing é 1: 2000.
– Usando outra pipeta, transfira 5 ml do tubo 2 para o tubo 3 e misture. A diluição closing é 1: 4000.
-Usando pipetas separadas de 1 ml, transfira 1 ml das diluições 1: 1000, 1: 2000 e 1: 4000 para suas placas de Petri adequadamente rotuladas.
– Despeje um tubo de ágar de soja tripticase fundido, resfriado a forty five ° C, em cada placa e misture por rotação suave.
– Permita que todas as placas solidifiquem. - Incubar todas as placas em uma posição invertida por 2 a 4 dias a 25 ° C.
- Study todas as diluições de placa lotada para colônias que exibem zonas de inibição do crescimento. Use uma lente de ampliação handbook, se necessário. Registro no relatório do laboratório O número de colônias mostrando zonas de inibição.
- Iseticamente isole uma colônia mostrando uma zona 34 de inibição do crescimento de cada cultura do solo
com uma agulha de inoculação e listras
As inclinações de ágar de soja tripticase marcadas com a amostra de solo da qual o isolado foi obtido
- Incubar as inclinações por 2 a 4 dias a 25 ° C. Isso servirá como culturas de estoque de isolados produtores de antibióticos a serem usados na Parte B.
Ii. Determinação do espectro antimicrobiano de isolados
Requisitos:
- Culturas:
- -Culturas de caldo de soja tripticase 24 horas de 24 horas de Escherichia coliAssim, Staphylococcus aureusAssim, Mycobacterium smegmatise Pseudomonas aeruginosa.
- Mídia:
Duas placas de ágar de soja tripticase. - Equipamento:
– Bunsen Burner
– Inocular loop
– Lápis de marcação de vidro.
Procedimento para determinação do espectro antimicrobiano de isolados.
- Rotule as placas de ágar de soja tripticase com a fonte da amostra do solo do isolado.
- Usando a técnica asséptica, faça uma inoculação de faixa de linha única de cada isolado na superfície de uma placa de ágar, de modo a dividir a placa ao meio
- Incubar as placas em uma posição invertida por 3 a 5 dias a 25 ° C.
- Após a incubação, no fundo de cada placa desenha quatro linhas perpendiculares ao crescimento do isolado produtor de antibióticos
- Assepticamente fazem uma inoculação de faixa de linha única de cada uma das quatro culturas de teste após o modelo de inoculação em cada placa. Comece perto de, mas não tocando, o crescimento do isolado produtor de antibióticos e estivesse em direção à borda da placa.
- Incubar as placas em uma posição invertida por 24 horas a 37 ° C.
- Study todas as placas para inibição dos organismos de teste e registre suas observações no relatório do laboratório.
Observações e interpretações de resultados:
- I: Isolamento de microrganismos produtores de antibióticos.
-O número de colônias mostrando a zona de inibição em diferentes diluições em série foi observado e foi cultivado ainda mais para obter culturas puras. - II: Determinação do espectro antimicrobiano de isolados.
- Desenhe uma representação da atividade antibiótica observada contra os organismos de teste.
- Com base em suas observações, registre no gráfico a presença (+) ou ausência ( -) da atividade antibiótica contra cada um dos organismos de teste e o espectro da atividade antimicrobiana (ampla ou estreita).