Co-autor de Sandra de Haan e Jingyan ele
Em nosso artigo recentemente publicado ‘Ectoderm Barcoding revela compartimentalização neural e coclear“Utilizamos o ultrassom guiado por injeções de nano de útero para fornecer códigos de barras de DNA hereditários a células expostas ao líquido amniótico, realizando o primeiro estudo de rastreamento de linhagem única de alto rendimento do sistema nervoso em desenvolvimento e ouvido interno. Nossos resultados levaram à reclassificação de linhagens celulares na cóclea e forneceram um atlas abrangente de células unicelulares das relações clonais neurais e cocleares.
Perspectiva de Sandra: o trabalho relacionado a esta publicação já começou muito tempo antes de eu (Sandra) ingressar no laboratório de Emma R. Andersson em 2019 para seguir meus estudos de doutorado. Trabalho realizado por Katrin Mangold e Jingyan He, estudantes de doutorado no laboratório na época, estabeleceram as bases para injeções de útero na cavidade amniótica para atingir a placa neural (Mangold et al, 2021). Como a placa neural, os progenitores do ouvido interno são expostos ao líquido amniótico durante uma janela de desenvolvimento inicial (~ E7 – E9) e, portanto, levantamos a hipótese de que poderíamos atingir o placode ótico e manipular progenitores do ouvido interno usando essa técnica. De fato, dados preliminares do aluno de um mestre, Sanne Stokman, mostraram algum direcionamento do sistema vestibular do ouvido interno. Esses dados sugeriram que devemos ser capazes de atingir a cóclea também – e lançou a base para explorar isso ainda mais durante meus estudos de doutorado. Com base em especialização de dois laboratórios – o laboratório de Andersson no Instituto Karolinska, especializado em biologia do desenvolvimento, sinalização de entalhes e em técnicas de injeção de útero, e o laboratório de Matt Kelley no segmentador de cochleia, a conduta de cochleia, em 2019, o que se direcionava à conduta de cochleia, em 2019. Injeções de lentivírus H2B-GFP de baixo titer realizadas por Jingyan. O direcionamento do tipo mosaico das células ciliadas ao longo da espiral coclear foi realmente notável (Fig. 1). Lembro -me de compartilhar esses resultados positivos iniciais com Emma through texto enquanto estava no microscópio confocal. Juntamente com Jingyan, que realmente dominou a técnica de injeção e, juntamente com a instalação do núcleo do Infinigene (estabelecida por Emma), otimizamos nossa estratégia de injeção para atingir o ouvido interno, incluindo o quantity de injeção, estágio embrionário e título viral. É claro que essa jornada não estava sem seus desafios. Às vezes, enfrentamos dificuldades com a criação de ratos, títulos virais baixos e, para não esquecer, uma pandemia que ocorreu ao longo do caminho. Finalmente, em 2022, as injeções usando vírus de alto titer produziram eficiências de alto alvo-de mais de 90% das células ciliadas e células de suporte no órgão de Corti. Lembro -me de observar a segmentação de alta eficiência, quantificando a eficiência da segmentação no remaining da noite no mesmo dia e apresentando os resultados no dia seguinte, o Zoom durante a reunião do Kelley Lab – animado para compartilhar os novos resultados.
Usando a entrega viral de códigos de barras de DNA hereditários, conseguimos realizar estudos de rastreamento de linhagem de alto rendimento na orelha interna pela primeira vez, respondendo a perguntas fundamentais sobre o desenvolvimento do ouvido interno. Ainda estou emocionado por podermos aplicar esse método avançado para explorar as relações de linhagem dentro do ouvido interno. Embora tenhamos se concentrado inicialmente na divergência de células cocleares medial e lateral, emblem percebemos que os achados mais intrigantes vieram de células fora do órgão de Corti, incluindo as células e populações de Hensen dentro da estria vascular. Uma das minhas idéias favoritas é a classificação das células de Hensen. Na época, mais pesquisas foram realizadas nessa população específica de células na cóclea, mas não existia consenso sobre se esse tipo de célula deveria ser considerado um subtipo de célula de suporte ou agrupado com células laterais ao órgão de Corti. Nossos dados indicaram que as células de Hensen devem ser classificadas como laterais para o órgão de Corti, em vez de ser um subtipo de célula de suporte do órgão de Corti – se basear essa definição em linhagens. Essa classificação pode ser relevante para estratégias futuras com foco na regeneração e diferenciação das células na cóclea. Esses achados também alinhados com os resultados de outro projeto de meus estudos de doutorado, nos quais mostramos que as células de Hensen respondem de maneira diferente à perda de ativação de Notch mediada por JAG1 em comparação com células de suporte lateral (De Haan et al 2024, Desenvolvimento).
À medida que a dissociação das células cocleares depende da luxação física através de microdissections, incluímos inadvertidamente tipos de células em nossa análise que não eram inicialmente o foco do estudo, incluindo neurônios em ganglionar e glia em espiral. A análise do compartilhamento de códigos de barras entre essas populações provou ser bastante complexa. A contaminação entre os neurônios gânglios espirais e as células da glia geralmente ocorre em preparações de célula única, por isso investigamos o compartilhamento de códigos de barras entre essas populações para determinar se period devido à contaminação ou se os subtipos de neurônios poderiam compartilhar uma origem comum com células glia, o que desafiaria a visão atual. Por fim, essa experiência me ensinou a importância de permanecer aberta a novas descobertas, garantindo que a coleta de dados e o design experimental sejam adequados para abordar as questões de pesquisa. Ele destacou a necessidade de planejamento experimental cuidadoso, coleta robusta de dados e validação para tirar conclusões precisas de conjuntos de dados complexos.
Perspectiva de Jingyan: Ao contribuir para o projeto de rastreamento de linhagem da orelha interna, I (Jingyan) também estava focado no objetivo abrangente dos meus projetos de doutorado: avançar a técnica de injeção de útero para rotular células não octodérmicas, com base no sucesso anterior no direcionamento do ectoderma. Ao explorar diferentes abordagens de injeção, estabelecei com sucesso uma técnica para rotular diversos tipos de células com outras origens embrionárias (trabalho em andamento). Como parte deste projeto altamente ambicioso, linhamos as células altas derivadas do ectoderme traçadas usando injeções de cavidade amniótica em E7.5. Coletamos embriões inteiros em E9.5 e E10.5 após a marcação de código de barras em E7.5 com injeção de cavidade amniótica. Essa abordagem nos permitiu estudar as relações de linhagem do sistema nervoso central, células derivadas da crista neural, bem como várias linhagens epiteliais, incluindo a linhagem ótica. Esta parte dos dados foi posteriormente incorporada ao papel de rastreamento de linhagem da orelha interna para adicionar uma compreensão mais abrangente do neurodesenvolvimento e ilustrar as possíveis relações clonais entre linhagens epiteliais óticas e outros tipos de células.
Um dos principais desafios deste trabalho foi equilibrar as eficiências de transdução viral em diferentes pontos do tempo de coleta para garantir um número superb de células marcadas para o sequenciamento de RNA celular único e análises clonais. Embora E9.5 e E10.5 estejam com apenas um dia de intervalo, a diferença no número complete de células é substancial. Tivemos que reunir alguns embriões E9.5 para obter números de células suficientes para análises clonais. No entanto, para o E10.5, se usamos a mesma quantidade de partícula viral e atingimos a mesma eficiência de transdução que a coleta E9.5, um único embrião E10.5 produziu tantas células marcadas que precisávamos dividi -las em várias reações ao preparar as bibliotecas de sequenciamento.
A própria eficiência da transdução viral foi influenciada por uma variedade de fatores, como as diferenças sutis dos estágios dos embriões ao injetar, tempo de armazenamento viral, ciclos de congelamento e descongelamento e a variabilidade entre diferentes lotes de produção de vírus, dificultando o controle consistente do número de células transduzidas recuperadas de cada injeção.
Os dias de coleta sempre foram altamente intensos e estressantes, envolvendo um fluxo de trabalho completo da configuração do classificador de células, coleta de embriões, dissecção, dissociação, classificação de células, para a preparação da biblioteca, tudo dentro de uma janela apertada para preservar a viabilidade celular e a qualidade do RNA. Sandra e eu sempre nos unimos para otimizar o fluxo de trabalho, ajudando-se com a preparação de reagentes, contagem de células e outras etapas sensíveis ao tempo.
Perspectiva conjunta: O manuscrito, inicialmente focado apenas na cóclea, foi enviado pouco antes da bem -sucedida defesa de doutorado de Sandra em agosto de 2024. Os dados de rastreamento de linhagem ectodérmica E9.5/E10.5 foram inicialmente destinados a uma publicação separada, mas em resposta ao revisor e suggestions editorial, decidimos incorporar -se a TI para o trabalho atual durante a publicação atual durante a participação atual. Essa adição enriqueceu significativamente o manuscrito e forneceu uma compreensão mais abrangente do neurodesenvolvimento. Como resultado, Jingyan e Sandra compartilharam a primeira autoria do artigo, destacando a natureza colaborativa de nossa pesquisa e a importância dessas descobertas.
Agora que o artigo foi publicado e novos projetos estão em andamento no Laboratório Andersson que aplica essa técnica a diferentes sistemas de tecidos, estamos empolgados em ver como a tecnologia será usada, desenvolvida e quais idéias biológicas ela descobrirá. Estamos orgulhosos de que nosso trabalho também tenha estabelecido as bases para uma concessão do consolidador de ERC ao Laboratório Andersson, que continuará empurrando as fronteiras da tecnologia – e o laboratório está procurando por Docs Publish!
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