Selecionando o método preferrred de isolamento do plasmídeo

Se você deseja isolar um plasmídeo e não tem certeza sobre qual método selecionar, deixe -me guiá -lo!

Existem vários métodos para isolando plasmídeo DNA, cada um variando no tempo necessário e na qualidade do plasmídeo obtido.

A qualidade do plasmídeo que você precisará para realizar o sequenciamento deve ser muito mais puro do que para um PCR de colônia. Assim, saber sobre o melhor método de isolamento para suas experiências a jusante pode melhorar significativamente seus resultados.

As duas técnicas mais prevalentes – lise alcalina e lise de ebulição – cada um oferecem benefícios específicos que podem atender a diferentes necessidades experimentais (Tabela 1).

Compreender as vantagens e processos distintos de cada um desses métodos o capacita a fazer uma escolha confiante que se alinha perfeitamente com seus requisitos. Este artigo fornecerá uma comparação clara para que você possa selecionar decisivamente a melhor abordagem para suas necessidades de extração de DNA.

Tabela 1. Comparações de aspecto -chave para métodos de lise alcalina e de ebulição para isolamento do plasmídeo.

Como funciona a lise alcalina

O método de lise alcalina aproveita as diferenças entre DNA plasmídico, que é pequeno e tremendous -bordoe DNA cromossômico, que é maior e linear.

Este método tem sido usado há anos para isolar plasmídeos de bactérias, como E. coli. Como o nome sugere, envolve células bacterianas lisadas sob condições altamente alcalinas na presença de SDs (dodecilsulfato de sódio).

Esse forte detergente, combinado com o pH alto, interrompe a parede celular, desnatura o DNA cromossômico e libera os plasmídeos no sobrenadante.

Você pode Leia mais sobre como funciona em nosso resumo dos métodos de miniprep.

Como funciona a lise fervente

O método de lise de ebulição emprega calor para quebrar células bacterianas abertas e desnaturar seus componentes celulares.

Nesta técnica, as bactérias são suspensas em uma solução contendo detergente e lisozima. Eles são então aquecidos a 100 ° C, o que interrompe as paredes celulares, separa os pares de bases de fios de DNA e as proteínas de desnaturações.

No entanto, o plasmídeo, devido à sua estrutura superenável, permanece intacto.

Quando escolher lise alcalina

A lise alcalina é famosa para produzir DNA de alta pureza com contaminação mínima, tornando-o um método amplamente preferido (consulte a Tabela 2).

Use lise alcalina quando:

1. Você precisa de DNA de alta pureza

Ao conduzir experimentos que requerem DNA plasmídico puro, livre de RNA, proteínas e DNA genômico, o método de lise alcalina é benéfico. Use -o para aplicações em que a contaminação é particularmente problemática, como:

• Transformação;
• Digestão da enzima de restrição;
• Preparando plasmídeos para transfecção celular de mamíferos;
• Gerando DNA para clonagem;
• Extraindo plasmídeos de alta qualidade para sequenciamento do genoma.

2. Você trabalha com uma gama diversificada de tamanhos de plasmídeo

A lise alcalina funciona bem com todos os plasmídeos pequenos, médios e grandes. A lise de ebulição, por outro lado, é menos eficaz para plasmídeos grandes, pois o aquecimento pode causar potencial degradação. Este método funciona bem para:

• Isolando grandes plasmídeos como o BAC (cromossomos artificiais bacterianos);
• Extraindo plasmídeos de alta cópia ou baixa cópia.

3. Você precisa de preparações para plasmídeos em larga escala

A lise alcalina é uma boa escolha em termos de escalabilidade. Seja miniprep (1-5 ml), midiprep (10-50 ml) ou maxiprep (100-500 ml), esse método combina com todos eles. Algumas aplicações incluem:

• Isolar e purificar grandes quantidades de plasmídeo para uso industrial;
• Preparação de estoques de plasmídeos para armazenamento a longo prazo.

4. Seu DNA plasmídico deve ser livre de contaminação

A lise de ebulição geralmente deixa contaminantes (RNA, proteínas e DNA cromossômico), o que pode dificultar seus resultados. A lise alcalina, por outro lado, inclui o tratamento com RNase, bem como a separação do DNA cromossômico para alta pureza. Devido à sua maior pureza, a lise alcalina pode ser usada para:

• Purificação do DNA do plasmídeo para estudos de estrutura cristalina;
• Preparando estoques de plasmídeos puros para aplicações de biologia sintética.

Quando escolher a lise de ebulição

A lise de ebulição, por outro lado, é um método de isolamento de plasmídeo rápido e barato. Embora não forneça DNA de alta pureza, é uma escolha preferrred para triagem rápida e tarefas de biologia molecular de rotina (Tabela 2).

Use lise em ebulição quando:

1. Você precisa do seu plasmídeo rapidamente

Todo o processo leva muito menos tempo que a lise alcalina. É conveniente para aplicações sensíveis ao tempo, como triagem de colônias ou testes de diagnóstico rápido. Este método pode ser usado em:

• Triagem rápida de transformantes após a ligação;
• Preparação rápida do plasmídeo para a verificação da digestão de restrição.

2. Você precisa manter seu trabalho de laboratório simples

A lise de ebulição requer menos etapas e reagentes mínimos, tornando -o acessível para laboratórios básicos ou trabalho de campo em comparação com a lise alcalina, que requer buffers caros e kits comerciais.

3. Você precisa de preparativos em pequena escala

Este método é principalmente eficaz para miniplieções e funciona bem com plasmídeos menores (<15 kb de tamanho). Para situações em que são necessárias apenas alguns microgramas de DNA plasmídico, a lise de ebulição oferece uma solução conveniente.

4. Sua preocupação não é DNA de alta pureza

Embora a lise em ebulição possa introduzir contaminantes de RNA e proteína, o que pode limitar seu uso em experimentos sensíveis, ele continua sendo uma técnica valiosa em situações em que a alta pureza não é crítica. Alguns exemplos incluem:

• Preparando plasmídeos para PCR de colônia ou mapeamento de restrição;
• Verificando a transformação plasmídica bem -sucedida.

Tabela 2. Resumo do qual o método de isolamento do plasmídeo é adequado para quais tipos de experimentos. (Fonte: Steffi Khatol 2025.)

Considerações especiais

Embora o método de lise de ebulição seja geralmente eficaz para muitas cepas bacterianas, é importante observar exceções específicas. Por exemplo, cepas de E. coli essa liberação de quantidades significativas de carboidratos após a exposição a detergentes, lisozima e calor – como E. coli A linhagem HB101 e seus derivados – não são candidatos ideais para este método.

Além disso, o método de lise de ebulição não é aconselhável para cepas de E. coli que a endonuclease expressa A. Isso ocorre porque a endonuclease A nem sempre é completamente inativada durante o processo de ebulição, levando à degradação do DNA do plasmídeo durante a incubação subsequente na presença de Mg²⁺.

Lise alcalina vs. lise de ebulição resumida

Ao isolar plasmídeos de bactérias, os pesquisadores costumam se transformar em dois métodos eficazes: a técnica de ebulição direta e o método alcalino completo. Este artigo forneceu uma comparação construtiva de ambas as abordagens, destacando suas respectivas vantagens e desvantagens. Ao entender esses aspectos -chave, você pode fazer uma escolha informada que se alinha aos objetivos específicos do seu experimento, garantindo um processo de isolamento plasmídico bem -sucedido e eficiente.

Para dicas e truques mais incríveis, confira nosso DIY no laboratório eixo.

Referências

1. Sambrook J. (2012). Clonagem molecular: um guide de laboratório. (4ª ed.) Chilly Spring Harbor, NY Chilly Spring Harbor Laboratory Press