Os mapas de plasmídeo não são intuitivos de ler. E se a primeira vez que você vê um é durante seus estudos de pós -graduação, pode ser um pouco embaraçoso admitir que você não entende o que está olhando. Além disso, você corre o risco de realmente atrapalhar as coisas quando tenta projetar e criar suas construções de plasmídeo.
Não se preocupe. Temos uma introdução útil para decifrar mapas de plasmídeos.
Familiarizando -se com seu mapa de interesse do plasmídeo
Vamos começar com um plasmídeo clássico: PBR322. (1) É frequentemente usado como espinha dorsal para vetores derivados porque possui todos os recursos necessários para a clonagem bem -sucedida (Figura 1).
No centro do mapa, podemos aprender que o tamanho do plasmídeo linearizado é de 4361 pares de bases (BP).
O texto azul em torno do exterior do mapa representa locais de restrição. Essas são as posições em que o plasmídeo será cortado se você o incubar com o correspondente Enzima de restrição.
Antes de começar a trabalhar com qualquer plasmídeo, é aconselhável linearizá -lo cortando com uma enzima de restrição e sequenciando -o by way of PCR para verificar se o tamanho e a sequência anunciados estão corretos. É melhor classificar qualquer problema de plasmídeo no início de um projeto, em vez de no meio do caminho.
Onde posso encontrar os websites de restrição?
Os locais de restrição para as enzimas correspondentes são mostrados como linhas verticais com a posição dos nucleotídeos iniciais. Os websites devem ser únicos, mas vale a pena verificar, pois os vetores derivados geralmente contêm sequências esquecidas adicionais.
As setas pretas mostram a direção da transcrição, essencial para a clonagem. Se você clonar seu gene de interesse no meio de outro gene, verifique se os dois são transcritos na mesma direção.
Caso contrário, o promotor nativo pode interferir na expressão do seu gene.
Se você precisar de uma atualização no básico, leia este artigo que explica Transcrição, tradução e dogma central da biologia.
O que significa “ori”?
Mapas e seqüências de plasmídeos origem da replicação do plasmídeoe se você estiver olhando para uma sequência linear de plasmídeo, ela será no início. Faça o que fizer, não mude! Uma vez que um plasmídeo é incapaz de replicar, é inútil.
Outra coisa a lembrar sobre o Ori é que Plasmídeos com a mesma origem geralmente são incompatíveis. Isso significa que você não poderá manter dois vetores derivados de PBR323 em uma célula, mesmo que eles tenham genes para diferentes resistências de antibióticos.
Por exemplo, o PBR322 ORI também está em PUC18entre os plasmídeos mais comuns usados em vetores eucarióticos.
Onde posso encontrar genes de resistência a antibióticos?
Muitos plasmídeos incluem genes de resistência a antibióticos, que permitem a seleção de colônias que expressam o plasmídeo.
O PBR322 possui dois genes de resistência a antibióticos: tet (resistência à tetraciclina) e Amp (Resistência à ampicilina). Esses genes codificam uma bomba de efluxo (tetR) e beta-lactamase (AmpR) que excreta tetraciclina e ampicilina da célula, respectivamente. Tet e Amp são lidos em direções diferentes.
Lembre-se de que a enzima beta-lactamase não é específica na desintoxicação de antibióticos derivados da penicilina. Portanto, mesmo se você tiver dois plasmídeos com diferentes origens de replicação, não poderá selecionar dois plasmídeos ao mesmo tempo se alguém expressar um gene de resistência à meticilina e o outro expressar um gene de resistência à ampicilina.
Isso ocorre porque os dois plasmídeos estarão sujeitos à mesma pressão de seleção, e os bugs provavelmente chutarão um dos plasmídeos se for desnecessário à sua sobrevivência.
Onde você corta o plasmídeo é importante – muito
Ao usar os locais da enzima de restrição para clonar seu gene de interesse no plasmídeo, observe cuidadosamente quais locais se enquadram no seu gene de resistência a antibióticos. Por exemplo, pvui corta no meio de AmpRe Bamhi corta no meio de TetR. E, como todos sabemos, a interrupção em um gene levará à inativação da função do gene – neste caso, resistência a antibióticos.
E você também precisa verificar se as enzimas de restrição escolhidas não cortam sua inserção. Verifique se a sua inserção contém um website de restrição que corresponde às enzimas de restrição escolhidas.
Como a replicação começa e para para?
Além dos genes, os plasmídeos geralmente incluem promotores de transcrição e terminadores derivados de E. coli fagos. Os promotores de Phages SP6 e T7 são frequentemente usados para in vitro Amplificação de RNA. Eles exigem polimerases fagáticas e são, portanto, inativas in vivo.
A Figura 2 mostra o mapa do plasmídeo de Ptlnx, um vetor de expressão de oócito de Xenopus. Além da origem acquainted PBR322 e genes de resistência a antibióticos AmpR e CmR (Resistência ao cloranfenicol), também existem promotores SP6 e LACUV presentes.
A jusante (em direção à extremidade 3 ‘) do promotor SP6, o terminador RRNBT2 permite uma terminação eficiente de genes clonados no native de clonagem múltipla. (2)
O vetor ptlnx também possui um gene para seleção de plasmídeos (ccdb), o sinal de localização nuclear do vírus SV40 e a região não traduzida de Xenopus Globin 3 ‘(UTR) que permite altos níveis de expressão de genes clonados.
Conheça a fonte do seu plasmídeo
Os mapas caseiros geralmente não são confiáveis, pois omitem os recursos que podem ser críticos para o seu experimento. Se você precisar de um mapa vetorial, é melhor usar repositórios de mapa conhecidos, como Addgene e websites de empresas que vendem seu vetor de interesse.
Círculo completo: mapas de plasmídeo resumidos
E isso foi um mapa plasmídico para os não iniciados. Você sabe onde procurar locais de restrição, a origem da replicação, tamanho do plasmídeo, resistência a antibióticos, direção da transcrição e muito mais!
E lembre -se de que os mapas de plasmídeo homebrew estão sempre evoluindo, por isso é provável que suas contribuições sejam deixadas para seus futuros colegas. Por favor, inclua o maior número possível de detalhes em seu mapa! Feliz mapa de leitura e desenho.
Publicado originalmente em março de 2019. Revisado e atualizado em julho de 2023.
Referências
- Balbás P, Soberón X, Merino E, Zurita M, Lomeli H, Valle F, Flores N e Bolivar F (1986) Vetor plasmídeo PBR322 e seus derivados de uso especial-uma revisão. Gene 50: 3–40
- Geertsma ER e Dutzler R (2011) Uma ferramenta de clonagem versátil e eficiente de alto rendimento para biologia estrutural. Biochem 50(15): 3272–8
