A coloração de imunofluorescência é um método de detecção fashionable e extremamente poderoso. No entanto, alcançar a imunofluorescência da qualidade da publicação ou a coloração de anticorpos fluorescentes pode ficar complicado. Portanto, é importante garantir que você tenha os controles corretos para a imunofluorescência.
Na minha experiência, o primeiro passo para obter coloração reproduzível e de qualidade é saber que seu Coloração de imunofluorescência é específico. Este artigo permitirá que você decida sobre os controles corretos para o seu experimento e usá -los para decidir se sua coloração funcionou ou não.
Por que precisamos de controles para imunofluorescência?
Na imunofluorescência, imagens coloridas são tão convincentes que é difícil imaginar que as informações que eles contêm podem estar erradas. No entanto, os cientistas experientes sabem que, para confiar em manchas, você precisa de controles mostrando que é específico.
Por exemplo, para saber que a coloração é actual e não devido à autofluorescência ou coloração não específica, você não precisa incluir controles primários de anticorpo ou isotipo em seu experimento. A inclusão de controles facilita sua interpretação de dados e ajuda a restringir o problema para a solução de problemas, por exemplo, quando você não recebe nenhum sinal.
O que os diferentes controles para a imunofluorescência dizem a você?
O tipo de controles para imunofluorescência que você usa dependerá do objetivo do seu experimento de imunofluorescência. Por exemplo, se você estiver tentando verificar as linhas celulares knockout, é importante estabelecer a especificidade do anticorpo.
Alguns dos Os controles mais comumente usados incluem um controle para mostrar a ligação específica de um anticorpo (omitir o controle primário), um controle positivo e omitir o controle secundário de anticorpos para entender o sinal de fundo da autofluorescência.
Eu listei cinco controles e cada um deles fornece informações diferentes para validar sua coloração se.
1. Controle positivo
Este é um controle para a imunofluorescência que você sempre deve usar em seus experimentos, pois é essential determinar se algo deu errado ou não durante a coloração. Um controle positivo pode ser qualquer tecido ou células onde se saiba que a proteína de interesse é expressa em abundância (ou onde você superexpressou a proteína através da transfecção).
Se você não vê manchas no seu controle positivo, sabe que algo deu errado com o protocolo de coloração.
2. Omitindo o controle principal de anticorpos
Incubando o amostra com tampão de diluição de anticorpos sem o anticorpo primário revelará se o sinal observado é devido ao ligação não específica do anticorpo secundário na amostra de tecido ou célula.
Às vezes, os anticorpos secundários se formam agregados e podem ser vistos como detritos na amostra. Isso pode acontecer devido a condições inadequadas de armazenamento. Portanto, sempre armazene seus anticorpos, conforme especificado pelo fabricante. E certifique-se de armazená-los em pequenas alíquotas para evitar a degradação de ciclos frequentes de congelamento e descongelamento.
Informe-se com o fornecedor para determinar se seus anticorpos secundários são pré-absorvidos. Pré-adsorção é uma etapa adicional de processamento, onde os anticorpos secundários são passados através de uma coluna contendo proteínas séricas imobilizadas de espécies potencialmente reativas.
O uso de anticorpos secundários pré-adsorvidos reduz o risco de reatividade cruzada com alvos não específicos.
3. Controle de absorção
Este é o controle em que você incuba sua amostra com um anticorpo primário imunológico. Ele demonstra a especificidade do seu anticorpo primário e você não verá nenhum sinal do anticorpo primário imunológico.
Os anticorpos imune depletados podem ser produzidos por incubação durante a noite do anticorpo a 4 ° C com um excesso de imunogênio.
Embora altamente recomendado, esse controle não é tão fashionable devido a limitações na obtenção de antígenos/imunógenos purificados. Esse controle é mais confiável quando o imunogênio é um peptídeo e não uma proteína.
4. Controle do isotipo
Incubação da amostra com um anticorpo não imune do mesmo isotipo (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgM) e na mesma concentração que seu anticorpo primário. Esse controle verifica se as interações não específicas do anticorpo primário não causam a coloração observada.
Qualquer mancha de fundo que observa com esse controle deve ser mínima e distinta da sua coloração específica. Esse controle é útil ao trabalhar com anticorpos primários monoclonais.
5. Omitindo o controle secundário de anticorpos
Amostras como cérebro, pulmões e células do cólon (ricas em elastina, colágeno e lipofuscina) tendem a ser ricas em autofluorescência. Nenhum controle de anticorpo secundário ajuda a determinar se a fluorescência observada é proveniente de autofluorescência em segundo plano.
Sempre mantenha um registro detalhado para garantir um desempenho consistente, pois qualquer variação alterará a reprodutibilidade da coloração.
Parece óbvio, mas A coloração de imunofluorescência é um processo longo com muitas etapas. Isso é essential Para otimizar cada etapa do protocolo antes de decidir gerar dados do seu materials de amostra.
Controles de imunofluorescência resumidos
Como qualquer outro experimento, o uso dos controles corretos para imunofluorescência pode economizar muito trabalho e reagentes, permitindo que você solucione a fonte do problema. Através Seleção cuidadosa de anticorpos e protocolo de coloração, é possível gerar toneladas de dados úteis.
Então agora você sabe quais controles você pode usar para solucionar, validar e melhorar seus dados para obter resultados com qualidade de publicação!
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Publicado originalmente em outubro de 2019. Revisado e atualizado em fevereiro de 2023.
