O peixe-zebra do tipo selvagem e a linha de peixe-zebra transgênica Elavl3: H2B-GCamp6f, KDRL1: EGFP, APO14: GFP e CMLC2: EGFP foram mantidos em aquários em condições de laboratório padrão (a 28 ° C sob um ciclo de 14 h luz escuro). As larvas de 5 a 7 dpf foram usadas nas experiências de triagem de drogas. Todo o trabalho animal foi realizado com a aprovação prévia do Comitê de Ética Animal da Universidade Solar Yat-Sen e estava de acordo com as diretrizes locais de cuidados com animais.
Fabricação do chip microfluídico
Fig. 7 ilustra o processo de fabricação do chip microfluídico usado no AISS. Os moldes do chip microfluídico foram usinados usando uma máquina controlada por computador de alta precisão (CNC, Dingsheng CNC Tools Co., Ltd.) com uma placa de cobre. Após a usinagem, os moldes foram embebidos em álcool 100 % durante a noite e subsequentemente enxaguados várias vezes. O polidimetilsiloxano (PDMS) foi então fundido nos moldes convexos preparados. Após a evacuação de bolhas de ar em uma câmara de vácuo, o molde revestido com PDMS foi curado a 80 ° C por 5-6 horas. A camada PDMS curada foi então desmembrada e processada para criar as entradas e as saídas. Finalmente, um tratamento de plasma (Shenzhen Sanhe Boda Electromechanical Know-how Co., Ltd.) foi empregado para unir permanentemente a camada microfluídica ao substrato de vidro, resultando nos chips microfluídicos finais utilizados neste estudo.
Fabricação de PCB
Um dos principais componentes do nosso sistema é a placa de controle, que é montada a partir de dois PCBs (FIG suplementar. S4A, b). Para reduzir o quantity e melhorar a capacidade de carga da corrente, a placa principal e o módulo de acionamento do motor foram projetados com quatro camadas de folha de cobre. Utilizamos pano de fibra de vidro como materials de reforço, ligado a resina epóxi e uma placa de cobre (FR-4, Jialichuang) para fabricar o PCB. Lead-free low-temperature soldering paste (LF999; KELLY SHUN) was employed to connect varied surface-mounted parts, together with the ARM Cortex-M1 MCU (STM32F103RCT6; STMicroelectronics), DC-DC converter (TPS54302DDCR, Texas Devices), microstepping motor Driver (A4988Settrt, Allegro), regulador de baixa gota (AMS1117, PUOLOP), MOSFETS N-CANAL (AO3400A, nascido), juntamente com vários resistores de montagem de superfície, capacitores e diodos por aquecimento a 230 ° C (FIG suplementar. S4C – F.).
Desenvolvimento de software program
O desenvolvimento do software program consistiu em duas partes primárias: (i) o sistema incorporado adaptado para o STM32F103RCT6 SOC e (ii) o programa de visão de computador baseado em OpenCV.
O firmware do STM32F103RCT6 foi escrito em C e utilizou a Biblioteca Padrão Peripherals. O firmware permitiu à placa principal receber comandos de porta serial do programa de visão computacional e controlar módulos elétricos individuais com rápida capacidade de resposta. Especificamente, facilitou a execução de vários modos de operação pré-embalados, incluindo controle flexível de válvulas microfluídicas e motores de passo para obter controle fluídico de alta precisão.
O programa de visão de computador foi desenvolvido no Python, capaz de emitir comandos de controle para a placa principal e o estágio XYZ motorizado através de uma porta serial enquanto processa tarefas visuais, permitindo que o sistema obtenha controle de loop fechado com base no suggestions visible. Seu design consistia em duas partes. Primeiro, a detecção visible no módulo de carregamento: após o processamento simples de filtragem e binarização das imagens adquiridas da câmera1, a presença de peixe -zebra no campo de visão da câmera1 pode ser determinada com eficiência, permitindo que o sistema aproveite o momento apropriado para transferir o Larva de peixe -zebra no módulo de exposição e imagem por drogas. Segundo, a detecção visible no módulo de exposição e imagem de drogas: depois de realizar filtragem mediana, binarização, erosão, dilatação e outros processos morfológicos nas imagens adquiridas pela câmera2, características importantes, como os olhos dos animais, podem ser segmentados com precisão e usados Para ativar o rastreamento de coordenadas e os comandos de controle correspondentes enviando (FIG suplementar. S3).
Reservatório de peixe -zebra
O reservatório de peixe-zebra period um recipiente do tipo cone com um raio de base de 8 mm, conectado aos tubos de silicone na parte superior e inferior. O ar foi injetado no reservatório a uma taxa de aproximadamente 45 μl/s para gerar bolhas de ar para elevar aleatoriamente a larva do peixe -zebra. Ao empregar as bombas, o tubo superior gerou uma pressão negativa a uma taxa de ~ 35 μl/s para desenhar o peixe -zebra.
Validação de concentração
Um micro-espectrofotômetro ultravioleta-visível (K5800C, Beijing Kaiao Know-how Improvement Co., Ltd.) foi usado para validar as concentrações finais das soluções de azul de metileno com base na relação proporcional entre a absorvância ultravioleta e a concentração da solução. Amostras com cinco concentrações de 5 µm, 20 µm, 50 µm, 80 µm e 110 µm foram preparadas para as determinações da absorção molar do azul de metileno. Essa curva de absorção molar foi usada para determinar a concentração closing das soluções difusas nas gotículas neste estudo.
Imagem
No AISS, três câmeras foram utilizadas. Duas dessas câmeras (MT9P031, Onsemi) foram empregadas para controle visible, operando a 30 qps durante o processamento visible. A terceira câmera, uma câmera de alta resolução (IMX183, Sony) foi utilizada para aquisição de dados, atingindo uma taxa de quadros de 35 fps. Para imagens fluorescentes, um microscópio fluorescente invertido totalmente automatizado (Leica Thunder DMI8) equipado com uma câmera CMOS de alta velocidade resfriada (DFC 9000GT) e um objetivo de 10 × (Na, 0,4). O software program LAS X foi instalado para controlar o microscópio. Ao executar imagens microscópicas em tempo actual na larva para obter dados, a câmera foi operada a uma taxa de quadros de 10 Hz para garantir que nenhuma informação foi perdida.
Tratamento químico
Neste estudo, foi realizado o tratamento de 10 minutos de Sertindol, seguido por um período de coleta de dados de 1 minuto. O Sertindole foi dissolvido no DMSO como um veículo para criar soluções de estoque de 10 mm. Sertindole foi comprado da Topscience Co. Ltd.
Avaliação da função cardíaca
Os indicadores das funções cardíacos foram calculados com base nas mudanças de valor em escala de cinza em torno do centro do ventrículo. Especificamente, os dados brutos foram extraídos e filtrados primeiro por um filtro Butterworth Band passa com frequência de 0,2 ~ 2Hz para remover o ruído. Em seguida, os dados filtrados seriam normalizados para uma análise mais aprofundada da função cardíaca, incluindo a frequência cardíaca (FC), a alteração da área fracionária (FAC), o quantity do AVC (SV) e o débito cardíaco (CO).
Primeiro, os picos dos dados de normalização foram contados automaticamente para obter o valor de RH.
Ao ajustar uma elipse bidimensional às bordas do ventrículo, os eixos longos e curtos correspondentes podem ser delineados. Isso permitiu o rastreamento de mudanças contínuas na posição da parede ventricular durante todo o ciclo cardíaco, identificando uma região de interesse linear (ROI). Desenvolvemos códigos para medir automaticamente a intensidade dos valores de escala de cinza de pixel ao longo dos eixos em cada ponto, registrando esses valores em uma matriz bidimensional (EU).
Nesta matriz, a primeira coordenada (t) representou o número da imagem seqüencial na série, enquanto a segunda coordenada (x) representou a posição dos pixels ao longo da linha ROI. Assim, qualquer valor específico lt, x na matriz representava a intensidade (um valor inteiro entre 0 e 255) na posição x Ao longo da linha no quadro t. Consequentemente, os comprimentos específicos dos eixos longos (DL) e eixos curtos (DS) foram medidos com base nas mudanças na borda ventricular e a área ventricular foi aproximada através do cálculo:
$$ {aria
Posteriormente, na diástole closing (ed) e nos valores de sistolas finish (s), os valores máximos (EDA) e mínimo (ESA) da área ventricular podem ser respectivamente, permitindo assim o cálculo da mudança de área fracionária (FAC) do ventrículo:
O FAC poderia ser usado para indicar a magnitude da contratilidade ventricular do peixe -zebra, com uma FAC maior representando uma contratilidade mais forte. Da mesma forma, calculando o quantity da elipse ajustada com base em seu DL e DSpodemos determinar o quantity ventricular:
Ao subtrair o quantity ventricular correspondente ao ED do ES, o quantity de AVC (SV), que foi usado para representar a quantidade de sangue ejetado pelo ventrículo durante o batimento cardíaco, foi obtido:
$$ { rm {sv}} = ({ rm {edv}}-{ rm {esv}}) $$
Onde o quantity diastólico closing (EDV) period o quantity do ventrículo quando foi preenchido durante a diástole; e o quantity sistólico closing (ESV) representou o quantity do ventrículo no closing da sístole.
Combinando SV e HR, o débito cardíaco (CO) pode ser calculado:
Os dados do gráfico de barras foram apresentados como a média ± erro padrão da média (SEM). Para as parcelas da caixa, a linha central vertical indicou a mediana, enquanto a largura da caixa e a barra de erro representava o intervalo interquartil (IQR) e 1,5 vezes o IQR, respectivamente. Um teste t de amostras independentes foi usado para calcular diferenças entre os dois grupos. A análise estatística foi realizada por análise de variância unidirecional (ANOVA) usando o SPSS Statistics 25 (IBM Corp., Armonk, NY). A diferença entre os grupos foi considerada estatisticamente significativa para *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 e ****p<0,0001.
