Nas plantas, o câmbio vascular, um nicho bifacial de células-tronco, impulsiona a formação da madeira gerando o xilema de um lado e o floema do outro. Neste put up, Ari Pekka Mähönen, Peter Etchells e Kirsten ten Tusscher contam a história por trás de seu artigo “Identificação de fatores de células-tronco do câmbio e seu mecanismo de posicionamento”.
Ari Pekka Mähönen:
No outono de 2009, retornei do meu período de pós-doutorado no laboratório de Ben Scheres, então localizado em Utrecht. Durante meu pós-doutorado, trabalhei no papel dos fatores de transcrição PLETHORA/AINTEGUMENTA-LIKE (PLT/AIL) na regulação de células-tronco no meristema radicular. Voltando à Finlândia, a minha ideia period estudar se algum destes factores se expressava no câmbio da raiz de Arabidopsis, o meristema que pretendia estudar no meu grupo de investigação recém-criado. Foi emocionante ver que o PLT5 mostrou expressão muito específica nas células cambiais em divisão (Figura), no entanto, estudos adicionais tiveram que esperar vários anos devido ao meu foco na finalização de projetos em andamento. Após obter financiamento para o meu grupo de pesquisa, um estudante de doutorado, Gugan Eswaran, começou a trabalhar no projeto e descobriu que ANT, PLT3 e PLT7 também são expressos no câmbio, sugerindo redundância genética no desenvolvimento do câmbio. Infelizmente, formiga mutantes únicos e plt mutantes triplos mostraram crescimento secundário apenas ligeiramente reduzido. Eu esperava um fenótipo mais forte de supostos fatores de células-tronco do câmbio. Nas tentativas subsequentes, a geração do mutante quádruplo falhou devido à letalidade inexplicável, e uma abordagem de microRNA synthetic também não forneceu fenótipos mais fortes. Isso foi decepcionante e assim Gugan começou a se concentrar mais em seus projetos paralelos. Então, o resgate do projeto veio alguns anos depois de uma inovação técnica. Xin Wang, um estudante de doutorado em meu laboratório, inventou um sistema indutível de edição de genoma (IGE) para plantas (Wang et al Nature Crops 2020). Este sistema IGE foi usado para gerar um quádruplo condicional formiga/plt mutante. Finalmente, este mutante apresentou crescimento radial severamente reduzido, algo que seria de esperar da perda de factores de células estaminais. Isso foi ótimo, mas é claro que agora tínhamos uma nova pergunta para responder – o que regula a expressão CAMBIUM-EXPRESSED AINTEGUMENTA-LIKE (CAIL) (o nome que demos a ANT, PLT3, PLT5 e PLT7) em um domínio tão estreito e específico? Eu acho que foi nesse ponto que você, Peter, me contatou, ou foi ainda mais cedo do que quando obtivemos os resultados do mutante quádruplo condicional?
pPLT5-GUS mostra expressão em células cambiais em divisão.
Pedro Etchells:
Entrei em contato enquanto Gugan fazia a construção do IGE. Eu tenho trabalhado na montagem das peças da sinalização PXY desde que entrei no laboratório de Simon Turner em Manchester em 2007, e isso continuou quando me mudei para o laboratório de Siobhán Brady na UC Davis em 2013. Durante todo esse período, através do meu trabalho e de outros no laboratório de Hiroo Fukuda, uma série de alvos PXY downstream, WOX4, WOX14, BES1, LBD4 e TMO6 foram identificados (Hirakawa et al Plant Cell 2012; Etchells et al Growth 2013; Kondo et al Nature Comms 2015; Smit et al Plant Cell 2020). No entanto, nunca fiquei satisfeito com o fato de todos os alvos transcricionais do TDIF-PXY terem sido descobertos. PXY é homólogo ao CLAVATA1, que regula o meristema apical do caule através da regulação do fator de transcrição do homeodomínio WUSCHEL (WUS). WOX4 e WOX14 são homólogos ao WUS, portanto foram um foco pure para investigação, mas wox4 wox14 os mutantes têm apenas um fenótipo de câmbio suave. BES1, LBD4 e TMO6 também são responsáveis apenas pela regulação de um subconjunto do pxy fenótipos. Parecia que estávamos faltando alguma coisa. A chave foi um experimento transcriptômico que demonstrou que os genes CAIL foram expressos diferencialmente em ambos pxy e linhas de superexpressão TDIF, realizadas no momento em que eu estava saindo do grupo de Siobhán para iniciar meu próprio laboratório em 2015. Para testar uma interação genética entre os CAILs e TDIF-PXY, cruzamos a linha de superexpressão TDIF, que é caracterizada por câmbio ectópico, plt357 mutantes. Embora o plt357 A linhagem sozinha não tinha um fenótipo de câmbio ela suprimiu os fenótipos associados à superexpressão de TDIF o que combinado com os padrões de expressão CAIL que o grupo de Ari Pekka tinha demonstrou que os genes CAIL tinham uma função de câmbio e eram provavelmente controlados por TDIF- PXY. Não demorou muito para que a linha IGE de Gugan fosse lançada e selasse o acordo. Ainda assim, a história estava incompleta porque o domínio de expressão PXY é muito amplo em relação ao dos CAILs.
Ari Pekka Mähönen:
Então, agora sabíamos que os CAILs são regulados pela through ligante-receptor TDIF-PXY. No entanto, ainda não sabíamos como é que os CAILs são expressos apenas numa região tão estreita nas células estaminais, dado que o domínio de expressão do receptor PXY se estende das células estaminais até ao xilema. Alguns pesquisadores do meu laboratório participaram na busca do mecanismo subjacente a esse rígido controle espacial, e de fato encontramos alguns mecanismos regulatórios de suggestions que poderiam ajudar a excluir os CAILs do xilema. Além disso, nos perguntamos se o sequestro eficiente da difusão do peptídeo TDIF pelo receptor PXY poderia desempenhar um papel na focalização da sinalização CAIL. Com toda a regulação de suggestions e um possível sequestro de TDIF, não tínhamos certeza de qual desses mecanismos (ou se algum desses mecanismos) poderia contribuir para estreitar a expressão de CAIL in planta. Portanto, entrei em contato com Kirsten ten Tusscher, uma bióloga computacional, com quem já havia colaborado antes na abordagem do papel dos genes PLT na zonação radicular (Mähönen, ten Tusscher et al. Nature 2014). Sugeri que poderíamos abordar esses diferentes cenários na sinalização TDIF-PXY-CAIL em um modelo computacional.
Kirsten dez Tusscher:
Como eu tinha gostado muito da nossa colaboração anterior, e as questões sobre padronização são o pão com manteiga da biologia computacional, esta foi, obviamente, uma oferta que não pude recusar. Felizmente, um talentoso aluno de doutorado do meu grupo, Jaap Rutten, já estava bastante adiantado com os resultados do projeto principal de sua tese de doutorado e aguardava dados experimentais. Assim, não foi difícil convencê-lo a ampliar seu horizonte além do controle do tamanho do meristema radicular, no qual estávamos trabalhando junto com Sabrina Sabatini, para o controle da padronização e posicionamento do câmbio junto com Ari Pekka e Peter. Para investigar a importância de diferentes mecanismos de suggestions, bem como o potencial de sequestro de ligantes na definição do domínio estreito da expressão do câmbio CAIL, começamos a construir um modelo incorporando todos os atores moleculares importantes e as interações regulatórias entre eles, usando novos e previamente publicados dados. Para começar, desenvolvemos um modelo para uma única célula e testamos se ele poderia modelar células do xilema, floema e câmbio, dependendo dos sinais recebidos. No entanto, para quem não é modelador, muitas vezes parece que se os modelos forem complexos o suficiente e você ajustar os parâmetros, poderá fazê-los fazer o que quiser. Portanto, period importante mostrar que a capacidade dos modelos de simular células formadoras de floema, xilema ou câmbio period uma propriedade muito genérica da arquitetura de rede modelada, e não de valores ou detalhes precisos de parâmetros. Para conseguir isso, Jaap realizou 1.768.593.750 simulações para testar extensivamente diferentes configurações do modelo, ocupando alguns de nossos computadores por semanas, e mostrar que o comportamento geral do modelo permaneceu o mesmo. No processo já pudemos confirmar que alguns dos comentários descobertos pela equipe de Ari Pekka de fato limitaram a formação do câmbio e promoveram a formação do xilema. Como próximo passo, poderíamos agora passar para um modelo unidimensional de uma faixa de células que se estende do xilema ao floema e começar a testar a hipótese de sequestro de ligantes. A chave para isso foi incluir um gradiente PXY dependente de auxina começando na extremidade do xilema do tecido, e um gradiente de TDIF decorrente da difusão de TDIF de células do floema produtoras de TDIF em nosso modelo. Com isso implementado, Jaap demonstrou que se a ligação do ligante TDIF aos receptores PXY for suficientemente forte, na posição do tecido onde o TDIF encontra os primeiros níveis baixos de receptores PXY, o TDIF é ligado e a difusão eficaz é interrompida, evitando ainda mais a interação TDIF-PXY. em direção ao xilema. Curiosamente, isto também explica porque o padrão das células estaminais do câmbio é robusto sob vários tamanhos de câmbio: quando o xilema e o floema estão mais afastados, o TDIF irá difundir-se ainda mais antes de atingir os primeiros receptores PXY e até esse momento ele se difunde livremente garantindo que ainda se encontrará Receptores PXY! No entanto, permaneceu uma questão importante: o mecanismo de suggestions regulatório descoberto anteriormente poderia, até certo ponto, limitar a expressão do CAIL. Assim, para testar qual desses mecanismos potenciais ocorre e/ou é mais importante in planta, testamos in silico o que aconteceria se diminuíssemos a expressão de PXY ou elevássemos os níveis de TDIF. Em seguida, esses experimentos também foram realizados em laboratório, com os resultados do laboratório correspondendo às previsões feitas pelo modelo baseado em sequestro. Isto finalmente nos permitiu consolidar a importância do sequestro para definir o domínio de expressão CAIL.
Ari Pekka Mähönen, Peter Etchells, Kirsten ten Tusscher:
Portanto, agora poderíamos dizer com segurança que o sequestro de TDIF é a chave para focar a sinalização de TDIF-PXY e, portanto, a expressão de CAIL em um domínio estreito para definir as células-tronco. O manuscrito foi submetido e recebemos comentários construtivos dos revisores, especialmente no fornecimento de mais evidências para o mecanismo de sequestro. Xixi Zhang, pós-doutorado no laboratório Mähönen, já havia começado a trabalhar na geração de linhas repórteres PXY. Ela notou, entre outras descobertas, que o repórter translacional pPXY:PXY-YFP tem um gradiente significativamente mais acentuado dentro do câmbio do que a linha repórter transcricional pPXY:erYFP, indicando que a proteína de fusão PXY-YFP é mais instável nas células do câmbio do lado do floema do que nas células do lado do xilema do câmbio. Como o ligante TDIF se origina do floema, isso sugere que a ligação do TDIF ao PXY poderia tornar o PXY-YFP instável. Assim, a regulação da estabilidade do TDIF-PXY pode ser o mecanismo chave para o sequestro, e é isso que Xixi está estudando agora, no seguimento do trabalho publicado.
No remaining, ver este artigo publicado foi particularmente gratificante, tanto pela longa jornada que foi necessária para finalizá-lo, como pela agradável colaboração que tivemos enquanto trabalhávamos juntos neste projeto.
