Os receptores acoplados à proteína G de adesão (aGPCRs) são cruciais para mediar diversos processos fisiológicos, como desenvolvimento cerebral, imunidade e organogênese. Caracterizados por suas grandes regiões extracelulares (ECRs) e domínios transmembranares de sete passagens (7TMs), esses receptores convertem estímulos (ou sinais) extracelulares, como forças mecânicas e ligação de ligantes em sinais intracelulares a jusante. No entanto, os mecanismos precisos subjacentes à ativação do aGPCR permaneceram indefinidos.
Nosso trabalho recente procurou abordar as principais lacunas nesse entendimento, concentrando-se em um mecanismo mediado pela região extracelular (ECR) – uma alternativa ao mecanismo de ativação convencional mediado pelo agonista amarrado (TA). Através de uma combinação de estudos estruturais e funcionais, fornecemos uma caracterização mais detalhada do mecanismo mediado por ECR e sugerimos que ele oferece um modo mais versátil de ativação do receptor. Aqui, resumimos nossas descobertas e suas implicações para a biologia do aGPCR.
Insights e desafios do mecanismo agonista amarrado
Durante anos, o campo tem se concentrado no modelo de ativação de aGPCR mediado por agonista amarrado (TA) (Fig. 1 – esquerda). Este mecanismo propõe que a autoproteólise dentro do domínio conservado GPCR Indutor de Autoproteólise (GAIN) permite a exposição de um peptídeo TA, que então ativa o receptor através de sua interação com o domínio transmembrana. Embora convincente e amplamente estudado, este modelo não explica todos os fenómenos observados e várias descobertas desafiam a sua universalidade:
Independência de autoproteólise: Alguns aGPCRs não possuem resíduos catalíticos para autoproteólise, mas permanecem funcionalmente ativos.
Ativação reversível: O mecanismo mediado por TA é irreversível (“pronto e pronto”), exigindo síntese de novo receptor para ativação repetida.
Restrições Biofísicas: As forças necessárias para expor o peptídeo TA são frequentemente maiores do que as forças biológicas típicas, levantando questões sobre a aplicabilidade deste mecanismo a todos os cenários fisiológicos.
Poderia um mecanismo alternativo resolver estas questões, oferecendo ao mesmo tempo uma forma de regulação mais flexível e reversível? Nossa hipótese é que o mecanismo mediado por ECR (Fig. 1 – direita), envolvendo o acoplamento conformacional direto entre as regiões extracelulares e transmembrana dos aGPCRs, poderia fornecer uma resposta a esses desafios. Para nosso estudo nos concentramos na Latrofilina-3 (ADGRL3), um ator chave nos processos de neurodesenvolvimento e oncológicos.
Figura 1. Mecanismos de ativação de GPCRs de adesão.
Insights estruturais sobre a ativação mediada por ECR – dos domínios ao holorreceptor
Estudar aGPCRs é um desafio, principalmente devido à sua estrutura complexa e às dificuldades técnicas em estabilizar seu estado completo para análise. Muitos estudos anteriores concentraram-se em domínios isolados, que, embora informativos, não conseguiram capturar a interação dinâmica entre as regiões extracelulares e transmembranares.
Em nosso trabalho, utilizamos microscopia eletrônica criogênica (cryo-EM), transferência de energia de ressonância Förster de molécula única (smFRET) e anticorpos sintéticos direcionados a ECR para explorar a dinâmica estrutural e funcional da latrofilina-3.
Através do crio-EM, resolvemos o modelo do holorreceptor Latrofilina-3, revelando características críticas de sua organização (Fig. 2a). Descobrimos que o domínio GAIN adota uma orientação paralela em relação à região 7TM e exibe movimento restrito, limitado a uma faixa de ~ 45° (Fig. 2b). Esta configuração sugere uma possível interação entre o ECR e o 7TM, apoiando um potencial modelo de acoplamento direto. É importante ressaltar que o peptídeo TA está firmemente compactado no núcleo do domínio GAIN, não é exposto ao solvente e não interage com o domínio transmembranar. Esta estabilidade estrutural contrasta com as suposições anteriores de extensa flexibilidade conformacional do ECR e é consistente com um mecanismo de transdução de sinal mediado por ECR.
Figura 2.Análise Cryo-EM de Laptrofilina-3. um O mapa composto da arquitetura holorreceptora da latrofilina-3. b Flexibilidade restrita do domínio Latrophilin-3 GAIN.
Modulação da atividade aGPCR por meio do acoplamento ECR-7TM
Para complementar nossos dados estruturais, utilizamos o smFRET para medir as mudanças conformacionais em tempo actual entre as regiões ECR e 7TM. Esses experimentos revelaram três estados conformacionais distintos e estáveis, com transições lentas entre eles (Fig. 3 – meio).
Ligantes de anticorpos sintéticos direcionados ao domínio GAIN forneceram evidências adicionais de sinalização mediada por ECR. Esses ligantes não apenas ajudaram na análise estrutural, mas também nos permitiram modular experimentalmente a atividade do receptor, fornecendo informações sobre como as forças extracelulares e os ligantes influenciam a sinalização do aGPCR.
Os anticorpos agonísticos alteraram o equilíbrio conformacional do receptor, promovendo estados potencialmente associados ao aumento da sinalização (Fig. 3 – esquerda). Por outro lado, mutações associadas ao câncer na interface GAIN-7TM alteraram a distribuição conformacional na direção oposta, levando à redução da atividade do receptor (Fig. 3 – direita).
Estas descobertas sublinham a relevância funcional do acoplamento ECR-7TM, correlacionando-o com a atividade de sinalização do receptor. Nossos resultados sugerem que a região extracelular se comunica diretamente com a região transmembrana, contornando a necessidade de liberação de TA em muitos cenários, reforçando a hipótese de um mecanismo alternativo de ativação mediado por ECR.
Figura 3. Anticorpos e mutações de doenças na interface ECR/7TM alteram as distribuições das conformações dos holorreceptores de latrofilina-3 e modulam a sinalização do receptor.
Mecanismo mediado por ECR oferece uma abordagem dinâmica e versátil para ativação de aGPCR
Nossos resultados propõem um modelo de ativação complementar onde o ECR modula diretamente o domínio 7TM através de interações transitórias, contornando a necessidade de exposição ao AT. Este mecanismo mediado por ECR oferece diversas vantagens:
Reversibilidade: Ao contrário da ativação irreversível mediada por TA, a ativação mediada por ECR pode ser regulada dinamicamente pela ligação do ligante ou por forças mecânicas, permitindo que o receptor alterne entre os estados ativo e inativo.
Sensibilidade a Forças Diversas: O mecanismo mediado por ECR permite que o receptor responda a uma gama mais ampla de estímulos mecânicos e responda às forças de tração e compressão.
Adaptabilidade Funcional: Este mecanismo acomoda a ativação em cenários onde a autoproteólise está ausente ou o peptídeo TA permanece enterrado no domínio GAIN.
Estas características sugerem que o mecanismo mediado por ECR opera juntamente com a ativação mediada por TA, fornecendo um package de ferramentas versátil para que os aGPCRs se adaptem a contextos biológicos variados (Fig. 4). O mecanismo de ativação mediado por ECR tem amplas implicações para o campo da biologia do GPCR. Os aGPCRs representam uma classe amplamente inexplorada de alvos terapêuticos, apesar do seu envolvimento em inúmeras doenças, incluindo câncer, distúrbios do desenvolvimento neurológico e disfunção imunológica. A correlação entre a conformação do receptor e as vias de sinalização específicas sugere um potencial de viés de sinalização, onde certos ligantes ou forças ativam preferencialmente uma through em detrimento de outra. A compreensão dos mecanismos de dupla ativação dos aGPCRs poderia ajudar no projeto de medicamentos que modulam seletivamente a atividade do receptor, adaptando estratégias terapêuticas a vias de sinalização específicas.
Figura 4. Interação proposta entre mecanismos de ativação de aGPCRs mediados por ECR e TA.
Conclusão
Cada etapa do nosso trabalho nos aproximou de uma compreensão holística desses receptores complexos. Descrevemos um mecanismo mediado por ECR que complementa o modelo estabelecido mediado por TA. Ao fornecer evidências estruturais e funcionais para o acoplamento direto ECR-7TM, nosso trabalho destaca a natureza dinâmica e versátil da sinalização aGPCR.
Embora tenhamos feito progressos significativos, muitas questões permanecem. Quão importante é a interação entre mecanismos mediados por ECR e TA para diferentes contextos fisiológicos? Qual é a generalização da ativação mediada por ECR em toda a família aGPCR? E que estratégias podemos explorar para traduzir esse viés de sinalização para benefício do tratamento, utilizando os estados conformacionais distintos dos aGPCRs?
Esses insights estabelecem as bases para futuras investigações sobre os diversos papéis dos aGPCRs e seu potencial como alvos terapêuticos.
