Protegendo o tumor: PMN-MDSCs como principais impulsionadores da imunossupressão na macroglobulinemia de Waldenstrom

A justificativa do estudo atual:

A macroglobulinemia de Waldenstrom (WM) é uma malignidade hematológica rara marcada pelo acúmulo de células de linfoma linfoplasmocitário na medula óssea (BM) e produção excessiva de anticorpos imunoglobulina M (IgM) (1). Enquanto alguns pacientes são assintomáticos ou apresentam uma forma “latente” (SMW) no momento do diagnóstico, outros desenvolvem sintomas devido aos altos níveis de IgM e à infiltração de células linfoplasmocitárias na MO, nos gânglios linfáticos e no baço (WM sintomática). A investigação genética identificou mutações no MYD88 (encontradas em 86-97% dos casos) e no CXCR4 (em 24-40% dos casos) como comuns na MW (2, 3). Embora os estudos genéticos tenham aprofundado a nossa compreensão da MW, os mecanismos que impulsionam a iniciação e progressão do tumor permanecem apenas parcialmente elucidados.

Na última década, o microambiente tumoral (TME) ganhou atenção por seu papel na promoção do crescimento e sobrevivência tumoral. O TME é um ecossistema complexo composto por células cancerígenas, fibroblastos associados ao câncer (CAFs), macrófagos associados a tumores (TAMs), células imunológicas incluindo células T, células B e células assassinas naturais (NK), bem como células endoteliais, pericitos e outras células do estroma (4). Também abrange células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), que desempenham um papel crítico na modulação das respostas imunes (5). Em condições normais, indivíduos saudáveis ​​mantêm baixos níveis de MDSCs, que desempenham papéis fundamentais na regulação das respostas imunológicas e na reparação de tecidos. Em humanos, as MDSCs são classificadas em dois subconjuntos: MDSCs monocíticas (M-MDSCs), caracterizadas por um CD11b+ HLA-DR^baixo CD14⁺ CD15^– fenótipo e MDSCs polimorfonucleares (PMN-MDSCs), identificados por um CD11b⁺ HLA-DR^baixo CD14^– CD15⁺/CD66b⁺ fenótipo. As MDSCs têm sido implicadas na promoção da progressão tumoral e na supressão imunológica em vários tipos de câncer, incluindo malignidades hematológicas (6). Neste estudo, observamos uma presença aumentada de MDSCs no microambiente imunossupressor da MW. Para explorar as interações entre MDSCs, células T e células linfoplasmocíticas malignas (CD19+ CD138+), utilizamos tecnologias genômicas unicelulares combinadas com ensaios funcionais para definir a assinatura genética de MDSCs em WM e identificar o subconjunto específico de MDSC responsável por T- inibição celular

Principais conclusões:

PMN-MDSCs são expandidos em pacientes com MW e estão associados a fatores de mau prognóstico

Nosso estudo revela que a MO de pacientes sintomáticos com MW exibe uma expansão de PMN-MDSCs (Figura 1 A e B), que desempenham um papel crítico na promoção de um microambiente imunossupressor. Mostramos que os níveis de PMN-MDSC aumentam com a progressão da doença e estão ligados a fatores de mau prognóstico, incluindo menor tempo até o próximo tratamento (Figura 1C). A citometria de fluxo e a análise CyTOF confirmam uma expansão significativa de PMN-MDSCs na MO de pacientes com MW. No entanto, o impacto específico das MDSCs na supressão imunológica e na progressão tumoral na MW não foi explorado anteriormente. Nossas descobertas estabelecem a presença dominante de CD66b⁺ PMN-MDSCs na MO de pacientes com MW (Figura 1D).

A supressão de células T mediada por PMN-MDSC CD66b+ prejudica a produção de TNFα e IFN-γ e se expande com G-CSF e TNF-α”

Nossas descobertas ressaltam o papel imunossupressor do CD66b⁺ PMN-MDSCs na inibição de CD4⁺ e CD8⁺ Função das células T (Figura 1E), levando à redução da proliferação de células T e à diminuição da secreção de IFNγ (Figura 1F) e TNFα (Figura 1G). Mostramos que CD66b⁺ PMN-MDSCs isoladas da medula óssea de pacientes com MW suprimem a atividade das células T, sendo este efeito mais pronunciado do que o observado com M-MDSCs. Isto é consistente com estudos que indicam que PMN-MDSCs de pacientes com câncer em estágio avançado são mais imunossupressores do que M-MDSCs (7). Mostramos também que o G-CSF e o TNF-α facilitam a expansão e o acúmulo de MDSCs em pacientes com MW (Figura 1H).

MDSCs exibiram inflamação regulada positivamente e assinaturas metabólicas:

As alterações observadas nos subconjuntos de MDSC em pacientes com MW resultam de uma expansão geral da população de MDSC, caracterizada por uma assinatura genética distinta, incluindo S100A8, S100A9, S100A4, TGFB1, CSF3R, LYZ, FOS e CCL2 (Figura 2B e C). Estas MDSCs expandidas exibem expressão aumentada de genes reguladores imunológicos, como CD86, HIF1-α, IL13RA1, IL10RA, TGFBI e CD74 (Figura 2C), ressaltando seu papel crítico no estabelecimento de um nicho de TME imunossupressor. Notavelmente, a análise de PCR confirmou a expressão elevada de HIF-1α em MDSCs WM em comparação com controles normais de medula óssea (NBM), validando os resultados do CITE-seq (Figura 2E). O aumento no HIF-1α sugere que condições hipóxicas dentro do microambiente WM BM podem impulsionar sua expressão em MDSCs, contribuindo assim para o seu fenótipo supressivo.

PMN-MDSCs exibem assinatura imunológica distinta associada a resultados desfavoráveis.

Nossas descobertas identificam IL2RG, FOXM1, PRTN3, SOX4, IGFBP7 e CXCR4 como genes característicos específicos para CD66b + PMN-MDSCs, destacando seu papel distinto dentro do TME. Este subconjunto exibe sinalização pró-tumoral aprimorada e características imunossupressoras mais pronunciadas em comparação com outras populações de MDSC na medula óssea. A expressão elevada de MPO, AZU1, ELANE e LDHB nessas células sugere aumento da mielopoiese, aumento da proliferação celular e uma associação com piores resultados clínicos (Figura 2D). Além disso, PMN-MDSCs CD66b+ expressam níveis mais elevados de reguladores do ciclo celular, como CDK1, CENPF, PLK1, MKI67 e HMGN2, consistentes com sua capacidade proliferativa aprimorada. As vias reguladas positivamente relacionadas à resposta ao dano ao DNA, apoptose, sinalização MAPK, sinalização TGFβ e diferenciação mieloide ressaltam ainda mais sua especificidade funcional. A validação qPCR da expressão de CXCR4, MPO e AZU1 em PMN-MDSCs em comparação com M-MDSCs em pacientes com WM (Figura 2F) corrobora os achados do CITE-seq, confirmando as propriedades profundamente imunossupressoras dos PMN-MDSCs.

Células linfoplasmocitárias de pacientes com MW recrutam PMN-MDSCs na medula óssea.

As células WM (BCWM.1 e MWCL-1) atraem preferencialmente PMN-MDSCs em vez de M-MDSCs para o native do tumor. A atração foi significativamente mais forte na presença de células WM intactas em comparação com seus sobrenadantes, destacando o papel basic das interações celulares diretas no recrutamento de PMN-MDSCs para o TME (Figura 3D e E).

Leve a mensagem para casa

Nosso estudo destaca a expansão de PMN-MDSCs no TME de pacientes com MW, ativamente recrutados por células WM para criar um microambiente imunossupressor de BM, inibindo diretamente as células T. Uma assinatura genética imunossupressora distinta de MDSCs de WM é caracterizada por vias inflamatórias reguladas positivamente ligadas à sinalização de INF e TNF. Estas assinaturas inflamatórias e imunossupressoras foram predominantemente enriquecidas em PMN-MDSCs. Também demonstramos que WM PMN-MDSCs suprimem a função das células T e sua viabilidade. Além disso, a presença de G-CSF e TNF no WM BM apoia a expansão de PMN-MDSCs. A segmentação de PMN-MDSCs pode, portanto, representar uma estratégia terapêutica promissora para a MW (Figura 3F).

Referências

1. Gertz MA. Macroglobulinemia de Waldenström: atualização de 2021 sobre diagnóstico, estratificação de risco e tratamento. Sou J Hematol. 2021;96(2):258-69.
2. Treon SP, Xu L, Guerrera ML, Jimenez C, Hunter ZR, Liu X, et al. Paisagem genômica da macroglobulinemia de Waldenström e seu impacto nas estratégias de tratamento. J Clin Oncol. 2020;38(11):1198-208.
3. Treon SP, Xu L, Yang G, Zhou Y, Liu X, Cao Y, et al. Mutação somática MYD88 L265P na macroglobulinemia de Waldenström. N Engl J Med. 2012;367(9):826-33.
4. de Visser KE, Joyce JA. O microambiente tumoral em evolução: desde o início do câncer até o crescimento metastático. Célula Câncer. 2023;41(3):374-403.
5. Gabrilovich DI, Nagaraj S. Células supressoras derivadas de mieloides como reguladores do sistema imunológico. Nature Revisa Imunologia. 2009;9(3):162-74.
6. Bhardwaj V, Ansell SM. Modulação da função das células T por células supressoras derivadas de mieloides em malignidades hematológicas. Entrance Cell Dev Biol. 2023;11:1129343.
7. Patel S, Fu S, Mastio J, Dominguez GA, Purohit A, Kossenkov A, et al. Padrão único de migração e função de neutrófilos durante a progressão do tumor. Nat Immunol. 2018;19(11):1236-47.

Figura 1: Expansão de PMN-MDSCs e aumento da supressão de células T em pacientes com MW. (UM) Análise estatística do whole de MDSCs em WM e NBM. (B) Análise estatística de PMN-MDSCs em NBM e WM. (C) Comparação do tempo whole até o próximo tratamento (TTNT) em pacientes com MW com CD66b alto e baixo⁺ células na medula óssea (7 meses (IC 95%: 2,3 – 49 meses) em comparação com 40 meses (IC 95%: 4,3 – 140 meses) p=0,01). (D) Gráficos t-SNE mostrando a expressão de três subconjuntos de MDSCs em NBM, Latente, Sintomático e Remissão, nomeadamente CD66b, CD68 e CD11c. (E) O gráfico representativo mostra o efeito supressor dos PMN-MDSCs quando cultivados com células T de doadores saudáveis ​​(proporção de 1:1 durante 24 h). A expressão de CD69 foi calculada como o MFI médio mostrado no gráfico de barras. (F) Parcelas representativas para supressão de INF-γ em células T CD4 por PMN-MDSCs (G) Gráficos representativos mostrando a expressão da citocina TNF-α em células T com a cocultura PMN-MDSCs e M-MDSCs. (H) Gráficos de representação mostrando expansão de PMN-MDSCs em 48h de cultura de G-CSF e TNF com MDSCs de medula óssea WM

Figura 2: Perfil transcriptômico de MDSCs (UM). Visualização do gráfico UMAP da medula óssea intratumoral e MDSCs detectadas em NBM e WM. (B) Mapa de calor mostrando uma expressão relativa de genes marcadores de cada cluster. Os clusters 2,3 e 9 representam células MDSCs. (C) Gráfico de vulcão de dados de transcriptoma CITE-seq exibindo o padrão de expressão gênica para MDSCs em NBM e WM. Genes expressos diferencialmente significativos em MDSCs WM vs NBM. Os genes altamente regulados positivamente e regulados negativamente são mostrados em vermelho e azul, respectivamente. (D) Gráfico de vulcão do perfil do transcriptoma exibindo o padrão de genes expressos diferencialmente em PMN vs M-MDSCs. Genes significativamente expressos são mostrados no gráfico, onde vermelho e azul representam genes regulados positivamente e regulados negativamente, respectivamente. (E) Análise qPCR da expressão de H1F-α em WM vs NBM (F) Análise qPCR da expressão de MPO, AZU1 e CXCR4 em PMN-MDSCs vs M-MDSCs.

Figura 3: PMN-MDSCs são atraídos por células B malignas no native do tumor (UM) Ensaio trans bem mostrando migração de MDSCs na presença de células BCWM.1 e MWCL-1. (B) Trans bem ensaio mostrando alta migração de PMN-MDSCs na presença de células BCWM.1 e MWCL-1. (C) Uma representação gráfica do TME na WM, destacando a interação das MDSCs com outros componentes do TME e suas assinaturas genéticas associadas.