Ultrapassando os Limites de Detecção de Proteínas

Os ensaios imunoenzimáticos (ELISAs) continuam a ser um método extremamente útil para medir proteínas mais de 50 anos após o seu desenvolvimento. (1)

Contando com as incríveis especificidades de ligação dos anticorpos, usamos ELISAs para detectar proteínas, hormônios e outras moléculas para muitas aplicações, incluindo testes microbianos, medições de citocinas e outros testes de diagnóstico.

Este artigo fornece uma breve explicação sobre digital ELISAs — um tipo diferente de ensaio ELISA que permite detectar vários biomarcadores simultaneamente, com limites de detecção extremamente baixos a partir de pequenos volumes de amostras.

O que é um ELISA?

Os ELISAs detectam e quantificam substâncias como proteínas, hormônios, patógenos e anticorpos.

Eles dependem da especificidade dos anticorpos para se ligarem à molécula alvo e de uma enzima para fazer uma mudança de cor, permitindo a detecção e medição.

Geralmente, uma curva padrão e controles positivos e negativos são incluídos nos kits de ELISA. Este artigo explica ELISAs com mais detalhesentão definitivamente dê uma olhada se precisar se atualizar sobre eles.

Apresentando ELISAs Digitais

Os ELISAs digitais representam um avanço significativo na metodologia ELISA. Recentemente, o limite de detecção foi bastante reduzido com o desenvolvimento de ultrassensíveis digital ELISA. Este novo tipo do ELISA pode detectar proteínas no femtomolar (10^-5) níveis e inclui Tecnologia Single-Molecule Array (Simoa), sistema Ella e ELISAs de eletroquimioluminescência.

Simoa, semelhante a alguns arranjos de esferas citométricas de fluxo, é um ensaio baseado em esferas magnéticas. Mas o que o torna ultrassensível é que as esferas são giradas em um disco e se acomodam em micropoços individuais, permitindo a detecção de fluorescência dependente de enzima por esfera.

Vantagens dos ELISAs Digitais

Os ELISAs padrão são fáceis de executar e não requerem equipamento especializado. No entanto, eles só podem medir um analito por vez e precisam de volumes de amostra maiores para executar poços replicados.

As matrizes de esferas citométricas de fluxo podem medir vários analitos (até 100) e requerem apenas pequenos volumes, mas são menos sensíveis que os ELISAs digitais. Os ELISAs digitais, embora exijam equipamento especializado e sejam mais caros, são os mais sensíveis e podem medir múltiplos analitos (até 6) com pequenos volumes de amostra.

Os ELISAs digitais oferecem inúmeras vantagens, incluindo a capacidade de detectar concentrações muito baixas (até 1000 vezes mais sensível que os ELISAs tradicionais) de biomarcadores e economizar tempo por meio da multiplexação.

Estudos do mundo actual usando ELISAs digitais

Indiscutivelmente, a sensibilidade de detecção com a tecnologia Simoa foi a que mais revolucionou o campo dos marcadores de lesões cerebrais, pois permitiu que NfL, UCH-L1, Tau (incluindo diferentes isoformas) e GFAP fossem medidos no sangue em lesões cerebrais traumáticas, bem como infecções como COVID-19 e doenças autoimunes.

Esses marcadores têm grande potencial como leituras de eficácia terapêutica em ensaios clínicos, para doenças como encefalite, Alzheimer e esclerose múltipla. (2)

Uma comparação de três métodos descobriu que Simoa foi o melhor para detectar o marcador de lesão cerebral NfL, pois period o mais sensível. (3) No entanto, descobriu-se que ELISAs e Simoa são comparáveis ​​ao medir peptídeos beta-amiloides no contexto de amiloidose cerebral. (4)

A complexidade da análise de dados também aumenta com os ELISAs digitais devido à necessidade de equipamentos e software program específicos da empresa. A Tabela 1 resume os pontos fortes e as limitações de cada método.

Tabela 1: Comparação de ELISAs, ELISAs digitais e matrizes de esferas citométricas de fluxo.

Para que são usados ​​os ELISAs digitais?

Ser capaz de detectar níveis femtomolares de proteínas tem muitas vantagens.

Por exemplo, ao detectar marcadores de lesão cerebral no sangue, eles geralmente estão presentes em quantidades muito baixas, mas ainda são significativamente mais elevados em condições de doença do que em controles saudáveis.

Como pós-doutorado, comecei a usar o Simoa para detectar marcadores de lesão cerebral no soro de participantes de pesquisas que tinham COVID-19. Encontramos níveis elevados de NfL-L em participantes que tiveram complicações neurológicas após a COVID-19, mesmo meses após a infecção.

Até agora, esta tecnologia tem sido utilizada em pesquisas científicas sobre:

• Imunologia
• Oncologia
• Cardiologia
• Doenças neurodegenerativas

Além disso, os ELISAs digitais têm implicações para muitas condições, incluindo a esclerose múltipla (marcadores de lesão cerebral utilizados como medida do estado da doença) e o cancro da próstata (detecção precoce de PSA).

O que você precisa para começar a usar ELISAs digitais

Várias empresas diferentes possuem sua própria versão da tecnologia multiplex ultrassensível, cada uma exigindo seu próprio equipamento e software program.

O equipamento de laboratório essencial de que você precisa inclui um agitador de placas com temperatura controlada, um lavador de placas magnético e pipetas multicanais.

Se você é novo em ELISAs digitais, precisará adquirir este equipamento e receber treinamento específico do instrumento para poder fazer a manutenção do equipamento, analisar os dados e solucionar problemas.

O que o futuro reserva? Quão baixos podem ser os limites de detecção?

O futuro da tecnologia ELISA parece promissor com o desenvolvimento contínuo de ensaios mais sensíveis com implicações clínicas para diagnóstico e prognóstico.

Esta é uma área de pesquisa ativa, com o dropcast Simoa já tendo uma sensibilidade 25x maior do que o Simoa, pois permite medir ainda mais moléculas alvo. (5) Fique atento a este espaço para a próxima geração da tecnologia ELISA!

ELISAs digitais resumidos

Os ELISA digitais proporcionam maior sensibilidade do que os ELISA normais, permitindo a detecção de proteínas presentes em quantidades muito baixas, o que é essencial para o diagnóstico precoce e a monitorização contínua de um grande número de doenças.

Se você estiver interessado em ampliar seu ensaio para medir ainda mais biomarcadores ao mesmo tempo, este artigo aborda os ensaio relacionado e muito versátil: conjunto de esferas citométricas.

Boa sorte com a pipetagem e execução dessas amostras!

Referências

1. Engvall E, Perlmann P. (1971). Ensaio imunoenzimático (ELISA) ensaio quantitativo de imunoglobulina G. Imunoquímica. 8(9):871–4

2. Wilson D, Chan D, Chang L, Mathis R, Verberk I, Montalban X, Kuhle J e outros. (2024). Desenvolvimento e validação multicêntrica de um imunoensaio digital totalmente automatizado para neurofilamento de cadeia leve: rumo a um exame clínico de sangue para lesão neuronal. Química Clínica e Medicina Laboratorial (CCLM). 62(2):322-331

3. Kuhle J, Barro C, Andreasson U, Derfuss T, Lindberg R, Sandelius Å, Zetterberg H e outros. (2016). Comparação de três plataformas analíticas para quantificação da cadeia leve do neurofilamento em amostras de sangue: ELISA, imunoensaio por eletroquimioluminescência e Simoa. Química Clínica e Medicina Laboratorial (CCLM), 54(10):1655–61

4. De Meyer S, Schaeverbeke JM, Verberk IM, Gille B, De Schaepdryver M, Luckett ES, Poesen Okay e outros. (2020). Comparação da quantificação baseada em ELISA e SIMOA das proporções plasmáticas de Aβ para detecção precoce de amiloidose cerebral. Pesquisa e terapia de Alzheimer. 12:1–16

5. Wu C, Jardim PM, Walt DR. (2020). Detecção ultrassensível de concentrações de proteínas attomolares por ensaios de molécula única dropcast. Jornal da Sociedade Química Americana, 142(28)