Citação: Plastrik AR, Zaher HS (2024) Não apenas um caminhão de lixo: a decomposição proibida desempenha um papel durante o desenvolvimento do embrião no peixe-zebra. PLoS Biol 22(12): e3002925. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002925
Financiamento: O trabalho no Zaher Lab é apoiado pelas bolsas do NIH R01GM112641 para HSZ e R01GM141474 para HSZ. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta e análise de dados, na decisão de publicação ou na preparação do manuscrito.
Interesses conflitantes: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
A síntese eficiente de proteínas depende da capacidade dos ribossomos de se moverem suavemente ao longo do modelo de mRNA durante a fase de alongamento da tradução. Bloqueios de mRNA impedem o trânsito do ribossomo e fazem com que ele pare (1). A estagnação persistente eventualmente leva à colisão dos ribossomos a montante com o ribossomo líder (2). Essas colisões podem ter impactos prejudiciais na homeostase celular. Para lidar com as colisões de ribossomos, os eucariotos desenvolveram o controle de qualidade do ribossomo (RQC) para resgatar os ribossomos e direcionar o peptídeo nascente para degradação.3). O processo está intimamente acoplado ao mecanismo de vigilância de mRNA de decaimento no-go (NGD), que tem como alvo o mRNA defeituoso para degradação. Embora os detalhes pelos quais ocorre a degradação do mRNA a jusante pareçam ser distintos entre leveduras e humanos, o sinal inicial para RQC e NGD é conservado.4). Ambos os processos são criticamente dependentes do reconhecimento de ribossomos colididos pela E3 ligase ZNF598, que adiciona cadeias de ubiquitina ligadas a K63 a várias proteínas ribossômicas.5). As proteínas ribossômicas ubiquitinadas recrutam a maquinaria de divisão do ribossomo (complexo RQT/ASC1), bem como os fatores de decaimento do mRNA (N4BP2/NONU-1/Cue2). Finalmente, o peptídeo nascente incompleto é apresentado ao proteassoma para degradação após sua ubiquitinação pela LISTERIN e liberação pela ANKZF1 (6). A paralisação generalizada do ribossomo esgota o mecanismo RQC e ativa a resposta integrada ao estresse (ISR) e a resposta ribotóxica ao estresse (RSR).7). ISR e RSR são ativados por ribossomos colididos através das quinases Gcn2 e ΖΑKα, respectivamente.
Embora tenha sido bem estabelecido que a NGD tem como alvo mRNAs defeituosos, incluindo aqueles danificados por agentes de alquilação e oxidantes.8) e irradiação UV (7); estudos sobre seu papel na regulação de mRNAs endógenos foram limitados. Notavelmente, NGD é uma das pelo menos três vias de vigilância de mRNA que incluem decaimento mediado por absurdo (NMD) e decaimento ininterrupto (NSD). Curiosamente, embora os estudos iniciais sobre NMD tenham se concentrado no seu papel como um processo de controle de qualidade direcionado a mRNAs que abrigam códons de parada prematuros, percebemos que o NMD é crítico para a diferenciação celular.9). Como resultado, é plausível que o RQC/NGD tenha sido reaproveitado para desempenhar um papel na expressão genética. Em apoio a esta ideia, estudos em leveduras e Caenorhabditis elegans identificaram com sucesso alvos endógenos para as DNG. No entanto, até que ponto a through regula a estabilidade do mRNA endógeno em vertebrados é pouco compreendida.
Nesta edição de Biologia PLOSIshibashi e colegas abordam isso diretamente usando a transição materna para zigótica (MZT) do peixe-zebra (10), já que este estágio de desenvolvimento é criticamente dependente da degradação do mRNA em larga escala. Estudos anteriores estabeleceram que três mecanismos contribuem para o decaimento do mRNA materno durante o MZT, que incluem otimização de códons, micro-RNAs e m6Uma modificação. Ishibashi e colegas procuraram expandir esses mecanismos e perguntaram se o NGD funciona com esses mecanismos para controlar a estabilidade do mRNA durante o MZT. Eles aproveitaram os recursos gerados anteriormente znf598 cepa mutante, que é incapaz de ubiquitinar ribossomos colididos e, como resultado, é deficiente em provocar NGD. Este mutante permitiu aos autores perguntar quais mRNAs são estabilizados na ausência de atividade do ZNF598 durante e brand após a fertilização. A análise de RNA-seq revelou que cerca de 200 mRNAs estão estabilizados em relação ao tipo selvagem 1 hora após a fertilização (hpf); um número semelhante de mRNAs foi estabilizado na marca de 6 hpf. Notavelmente, apenas ~50 destes mRNAs se sobrepuseram entre os 2 estágios de desenvolvimento, sugerindo que o ZNF598 desempenha um papel na regulação dos mRNAs maternos e zigóticos. Mais importante ainda, embora nenhum enriquecimento funcional óbvio tenha sido detectado para mRNAs que foram estabilizados em 1 hpf no znf598 cepa mutante, aqueles estabilizados em 6 hpf exibiram um enriquecimento significativo para mRNAs contendo o domínio de dedo de zinco do tipo C2H2 (C2H2-ZF).
Destacando o papel mecanicamente distinto do NGD na regulação da estabilidade do mRNA durante o MZT, Ishibashi e colegas não encontraram nenhuma sobreposição significativa entre seus alvos e aqueles que foram anotados como alvos para codon-optimality-, miRNA-, e m6Decadência baseada em A. Embora os mRNAs que codificam os domínios da proteína C2H2-ZF pareçam ser direcionados para a degradação dependente de ZNF598, não está claro se o decaimento é desencadeado através de um mecanismo baseado em NGD. Ishibashi e colegas forneceram três linhas de evidência para sugerir que os mRNAs são de fato alvos de NGD: (1) o bloqueio do início da tradução os estabilizou; (2) ao contrário do mecanismo baseado na otimização do códon, a deadenilação parece não ter nenhum papel no processo de decaimento; (3) a inibição da ubiquitinação da proteína ribossômica eS10 retarda a decomposição.
Tendo estabelecido que os mRNAs que codificam C2H2-ZF são prováveis alvos de NGD, Ishibashi e colegas procuraram em seguida verificar se sua decadência é desencadeada pela paralisação do ribossomo. Eles utilizaram um repórter baseado em mRNA que codifica um Renila luciferase (Rluc) e luciferase de vaga-lume (Fluc) separadas pela sequência de salto de ribossomo P2A. Inserção de regiões de codificação C2H2-ZF em tandem do ZNF236 ORF entre as 2 luciferases resultou numa diminuição significativa da luminescência de Fluc em relação à de Rluc. Conseqüentemente, os domínios C2H2-ZF retardam o alongamento da tradução. Curiosamente, e em contraste com o que foi observado em leveduras e humanos, a inativação de ZNF598 não levou à leitura dessas sequências de parada provisórias, mas em vez disso reforçou a parada nelas. Em specific, a injeção de znf236 mRNA em MZznf598 os embriões produziram mais produtos proteicos abortivos e significativamente menos produtos proteicos completos em relação às injeções em embriões do tipo selvagem. Finalmente, usando o perfil do ribossomo e um novo escore dissome, Ishibashi e colegas revelaram que o decaimento dos mRNAs que codificam C2H2-ZF se correlaciona com os picos dissome. Em conclusão, os ARNm que codificam C2H2-ZF parecem ser propensos a estagnação e eventuais colisões de ribossomas que por sua vez iniciam a sua degradação através de NGD.
Este novo estudo lança alguns insights importantes sobre o papel potencial de um processo de controle de qualidade no desenvolvimento de vertebrados. No entanto, várias questões relativas à especificidade, mecanismo e utilidade da NGD na regulação da expressão genética permanecem sem resposta (Figura 1). A principal destas questões é quão conservado é este modo de regulação. Os autores tentaram abordar esta questão em células humanas; e embora observem um aumento na paralisação em C2H2-ZFs quando inseridos em um repórter de luciferase dupla, a deleção de ZNF598 não alterou a taxa de decaimento dos mRNAs endógenos. É possível que a NGD tenha como alvo uma classe diferente de mRNAs em humanos, dependendo do tipo de célula e do estágio de desenvolvimento; estudos mais cuidadosos são necessários para compreender o papel do NGD em outros vertebrados. Igualmente importante é se e como o RQC e o NGD são regulamentados ao longo do desenvolvimento e da diferenciação. Mais especificamente, a atividade do ZNF598 é regulada através da sua expressão e/ou mecanismos pós-tradução? Da mesma forma, quais características dos mRNAs que codificam C2H2-ZF são responsáveis pela paralisação? Ishibashi e colegas sugeriram que a carga positiva do peptídeo nascente e o contexto do códon em torno das regiões C2H2-ZF podem explicar parcialmente o seu comportamento de estagnação. No entanto, está claro que parar nessas sequências é mais complexo do que isso. Seria interessante avaliar o papel do dobramento co-traducional e dos acompanhantes associados na estagnação. Talvez a questão mais importante ainda a ser abordada seja a importância deste modo de regulação na diferenciação celular. O Zebrafish MZT parece ocorrer bem na ausência de ZNF598 e NGD a jusante, sugerindo que o processo não é crítico para o MZT. E embora os animais adultos jovens sejam menores em relação aos do tipo selvagem, este fenótipo parece ser o resultado da superativação do ISR, e não da superabundância de alvos NGD por si só. Mais trabalho é claramente necessário para compreender completamente a relevância funcional do RQC e do NGD em outras espécies, e como suas atividades se cruzam com outras vias, como o ISR e o RSR (7).
Figura 1. Os mRNAs que codificam C2H2-ZF param os ribossomos e estão sujeitos a NGD mediada por ZNF598 em peixe-zebra.
Falta uma compreensão completa dos fatores que retardam a tradução desses motivos. É assim que o processo pode ser regulamentado. Da mesma forma, ainda não está claro como outros mecanismos de detecção de colisão (GCN2 e ZAKα) impactam a função do ZNF598. Se o ZNF598 é regulamentado durante o desenvolvimento requer uma investigação mais aprofundada. O mecanismo pelo qual os mRNAs são degradados não foi rigorosamente explorado. Finalmente, os alvos endógenos para a DNG em humanos ainda não foram identificados.
