O RUNX1 é um fator de transcrição que desempenha o papel do “regulador mestre da hematopoiese” através da ação antagônica de suas três principais isoformas de proteínas, Runx1a, B e C. runx1a (a menor entre eles) representa uma fração menor do pool de isoforma (Figura 1). O RUNX1A mostra a ligação aprimorada do DNA, cofatores específicos e efeitos divergentes na transcrição do gene alvo em comparação com Runx1b/c. Aumenta a atividade de auto-renovação e suprime a diferenciação mielóide, e sua superexpressão pode ser leucemogênica, como sugerido por estudos adicionais em outras doenças sanguíneas. Dado o papel central do Runx1 Gene na leucemia mielóide aguda (AML), avaliamos a expressão de suas isoformas em nossa série, com o objetivo de elucidar o papel do Runx1a Na patogênese da LBC, suas possíveis associações com diferentes subtipos de doenças e sua influência durante o curso da doença.
Figura 1. Representação esquemática de Runx1 Três principais isoformas de transcrição e seus respectivos produtos proteicos. Runx1a, interagindo com cofatores específicos, melhora a atividade de auto-renovação e suprime a diferenciação mielóide. Runx1 aAssim, B e C A quantificação relativa (como a fração dos transcritos totais de Runx1) em controles saudáveis é relatada no canto superior esquerdo. P1: promotor distal; P2: promotor proximal; RHD: Domínio Runt-Homology; TAD: domínio de transativação; HC: Controles saudáveis.
Comparando casos de LBC no diagnóstico (n = 138) com HC (n = 11), observamos a superexpressão de Runx1a (0,027 vs 0,003 runx1a/gusb (r/g); p <0,0001) e Runx1b (0,827 vs 0,433 r/g; p = 0,006), enquanto nenhuma diferença foi observada para Runx1c (Figura 2a). Os casos trombocitopênicos (n = 93) apresentaram níveis mais altos dessas duas isoformas em comparação com as AMLs com níveis normais de plaquetas (pLTs) (n = 23) (0,030 vs 0,014 r/g; p = 0,002 e 0,876 vs 0,517 r/g; p = 0,007, respectivamente) confirmando o envolvimento previamente estabelecido de Runx1 Gene na megacariocitopoiese (Figura 2B). Dado o papel leucemogênico conhecido de Runx1a e sua superexpressão mais pronunciada em comparação com a outra Runx1 isoformas (aumento de 10 vezes entre os níveis medianos de LMA e HC), decidimos nos concentrar em Runx1a Expressão e sua possível associação com a patogênese da AML.
Figura 2. (A) Comparação de Runx1 Expressão entre controles saudáveis e casos de LMA no diagnóstico (isoformas únicas e sua soma são relatadas). (B) Runx1 Expressão de acordo com o número de PLTs do paciente. (C) Representantes ImmunoBlot Picture de Runx1a e beta-actina (superior esquerda). Análise densitométrica de bandas RUNX1A, expressa como densidade óptica relativa e normalizada para beta-actina (inferior-esquerda). Comparação entre os níveis de proteína HC e AML RUNX1A (superior – direito). Regressão linear simples entre o Runx1a Níveis de transcrição e proteína (parte inferior direita). (D) Níveis de transcrição RUNX1A de acordo com as lessons FAB. (E) Runx1a nível de transcrição em casos de LBC subdivididos por FLT3 standing mutacional; (F) uma análise detalhada de FLT3-Pacientes é relatado. ITD curto: comprimento de duplicação ≤ 50bps, ITD longo: comprimento de duplicação> 50bps. (G) Runx1a Cinética do diagnóstico ao CR. (H) Comparação de Runx1 Expressão entre controles saudáveis e casos de LMA na recaída da doença (isoformas únicas e sua soma são relatadas). (EU) Runx1a cinética do diagnóstico à recaída da doença, para quatro casos que eram FLT3-Itd negativo no início da doença, mas FLT3-Itd mutado em recaída. (A, B, D, E, F, H) Boxplots representando a distribuição. As caixas se estendem dos percentis 25 a 75. A linha na caixa representa o valor mediano. Os bigodes variam do menor valor ao maior. HC: Controles saudáveis; AML: Leucemia mielóide aguda; PLT-: casos trombocitopênicos (<150.000 pLTs/ul); CR: Remissão completa.
Em primeiro lugar, verificamos a superexpressão de Runx1a no nível da proteína por análise de imunotransferência (Figura 2C). Os níveis aumentados de proteína Runx1a foram observados em pacientes com LMA em comparação com HC (2,018 vs 0,082 runx1a/b-actina, p = 0,0005), e uma correlação positiva foi encontrada entre a transcrição do RUNX1A e os níveis de proteína (r (rs= 0,805, p = 0,025) (Figura 2C).
Runx1a Os níveis foram maiores em pacientes com LBC com um fenótipo mais imaturo e caracterizados por diferenciação granulocítica prejudicada (M0-M3) em comparação com os casos que mostram uma morfologia monocítica (M4-M5), de acordo com o conhecido Runx1a Capacidade de suprimir a diferenciação mielóide, aumentando a capacidade de auto-renovação das células-tronco hematopoiéticas (HSCs) (Figura 2D). Nesse contexto, as lessons M6 e M7 pareciam seguir outras vias, que não podemos abordar, dada a raridade dos casos entre os inscritos.
De acordo com o perfil mutacional, FLT3-Itd casos positivos apresentados o mais alto Runx1a níveis (0,071 r/g) e a presença de FLT3-Itd foi a única variável molecular capaz de influenciar o Runx1a expressão (p = 0,0005). FLT3-Itd AMLs (n = 23) mostrou maior Runx1a níveis que FLT3-wt casos (n = 82) (0,071 vs 0,020 r/g, p <0,0001), pelo contrário FLT3-TKD pacientes (n = 10) mostraram menor Runx1a níveis que FLT3-WT (0,006 vs 0,020 r/g, p = 0,025). Runx1a A superexpressão foi maior em casos de ITD longos (> 50bp, n = 11; caracterizados por mais FLT3 Auto-fosforilação e maus resultados de sobrevivência) quando comparados com os ITD curtos (n = 8) (0,131 vs 0,037 r/g, p = 0,02) (Figura 2e-f).
Com o objetivo de estudar Runx1a Expressão cinética durante o curso da doença, avaliamos os níveis no estágio de remissão completa (CR) e na recaída da doença (DR). Quando os pacientes alcançaram CR, seus Runx1a Níveis revertidos para valores normais (Figura 2G). No dr, o Runx1a A superexpressão reaparece sem uma cinética clara, exceto nos casos FLT3-Itd negativo no diagnóstico (n = 4), mas FLT3-Itd mutado no dr que exibiu um aumento Runx1a expressão (p = 0,033) (Figura 2H-I).
O Runx1 cooperação com FLT3-Itd na indução de leucemia já é conhecido: FLT3-Itd Os pacientes com LBC expressam altos níveis de Runx1. Notavelmente, nenhum estudo se concentrou especificamente na expressão dos três Runx1 isoformas. No entanto, foi demonstrado que o Runx1 A regulação positiva na LMA positiva de FLT3-ITD pode resultar parcialmente da presença de uma região aberta específica de ITD de cromatina (um native hipersensível da DNase I-DHS) dentro do Runx1 gene, aproximadamente 10kb a montante do exon 6, cujo splicing alternativo gera o Runx1a isoforma. Embora não possamos verificar essa conexão direta, é concebível que em FLT3-Itd LMA, esta região aberta no remaining do exão 5 do exão pode facilitar o acesso ao regulador, promovendo a emenda alternativa em favor de Runx1a Produção, conforme descrito recentemente (Figura 3).
Figura 3. Ilustração de uma possível conexão molecular entre FLT3-Itd e Runx1a Superexpressão, com base em dados recentes da literatura.
Para verificar se Runx1a A regulação positiva está ligada a um perfil transcricional específico, foi realizada o sequenciamento de RNA de alto rendimento. Um complete de 756 genes codificadores de proteínas (557 e 199 para baixo) e 1.159 elementos pertencentes a outras categorias (lncRNAs, miRNAs, pseudogenes and so forth.) foram expressos diferencialmente entre casos com “alto” e “regular/baixo” Runx1a níveis.
“A degranulação de neutrófilos” (p = 5,85e-20) foi identificada como a by way of canônica superior desregulada, com 56 graus; A maioria deles é genes desregulados. O estado de ativação da by way of foi identificado como “diminuído” (escore z = -6.682) (Figura 4A). Curiosamente, essa observação está alinhada com o conhecido Runx1a capacidade de suprimir a diferenciação mielóide e com o mais alto Runx1a Níveis observados em nossos casos de LBC com um fenótipo mais imaturo e caracterizados por diferenciação granulocítica prejudicada (M0-M3). Notavelmente, ao se concentrar nos cinco primeiros degs (regulados e regulados antecipados) entre os dois grupos (Figura 4b), o POU4F1 (Log2fc = 6,72, PADJ = 0,009) e Sfrp1 (Log2fc = -5,33, PADJ = 0,005) Os genes se destacam. Na verdade, POU4F1 A superexpressão já foi associada a Runx1 :: runx1t1 LMA e é conhecido por contribuir diretamente para sua assinatura transcricional exclusiva; pelo contrário, Sfrp1 é um alvo de repressão transcricional da proteína de fusão RUNX1 :: RUNX1T1 na LMA.
Figura 4. (A) As dez principais vias canônicas desreguladas identificadas a partir da análise IPA. (B) Gráfico de vulcão visualizando genes codificadores de proteínas expressos diferencialmente (com valor p <0,05) entre os dois grupos de pacientes (alto e regular/baixo Runx1a expressão). Os genes regulados (log2fc> 1,5) e regulados (log2fc <-1.5) são marcados em vermelho e verde, respectivamente. Os cinco principais genes codificadores de proteínas desregulados são relatados na tabela (superior-direito).
A heterogeneidade biológica da ABCD ressalta a necessidade de insights mais profundos sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento da doença. Nossos dados têm como objetivo contribuir com uma nova peça para a quebra da patogênese molecular da ABC, na qual Runx1 O envolvimento é estabelecido. Nosso esforço para esclarecer o lado escuro de Runx1 A desregulação também pode oferecer a oportunidade de olhar Runx1a Como um novo alvo terapêutico da AML. De fato, restaurando o Runx1 O equilíbrio de isoformas pode reverter o potencial oncogênico da isoforma A, como mostrado recentemente na síndrome de Down-leucemia mielóide associada (ML-DS). Enquanto isso, outra peça foi adicionada ao complexo cenário da patogênese da AML.
