Após o transplante de terapias celulares regenerativas, a adesão é o primeiro e mais crítico passo em direção à integração funcional das células terapêuticas. As células transplantadas devem chegar ao native e se ancorar com sucesso por tempo suficiente para enxertar e funcionar. No entanto, muitas células terapêuticas que demonstram promessa para reparo e regeneração não conseguem aderir robustamente após o transplante. A modificação genética tem sido classicamente uma estratégia de pedra angular para as superfícies celulares de engenharia com porções não nativas, sendo o exemplo principal, receptores de antígeno quimérico das células CAR-T. Essa abordagem permite a expressão de proteínas da superfície, mas requer fabricação complexa, coloca desafios regulatórios e carrega riscos mutativos inerentes. Portanto, nossa equipe ficou interessada em enfrentar o problema do mau enxerto de uma perspectiva de engenharia química.
Inspirado pelo papel que os polissacarídeos desempenham dentro de adesão úmida in vivoexploramos o uso de biomateriais de polissacarídeos como funcionalidades da superfície, especificamente ácido hialurônico (HA) e alginato (ALG). Nossa hipótese foi de que esses polímeros de açúcar “doces e pegajosos” podem ajudar a adesão, facilitando mecanismos multimodais de ligação de hidrogênio, van der Waals e CA2+ Coordenação entre as superfícies das células transplantadas e as células endoteliais.
Com base no trabalho seminal do Prof. Bertozzi e colegas, adotamos a engenharia metabólica de oligossacarídeos (MOE) como um método para conectar esses biopolímeros às células regenerativas. Isso envolve a instalação de âncoras de azida nos sialosídeos da superfície terminal de células progenitoras hepáticas (HPCs), através das quais fomos capazes de ‘clicar quimicamente’ polissacarídeos adesivos na superfície celular (Fig. 1). Essa abordagem não genética expande a infinidade de potenciais modificações de superfície para terapia celular para produtos gênicos não canônicos, como macromoléculas sintéticas e naturais, conforme usado em nosso estudo.
Figura 1. Esquema da marcação metabólica do glicano de células de mamíferos, resultando na incorporação de N-zidoacetil-d-neuramínico (neuaz) em sialossídeos da superfície, ao qual conectamos ácido hialurônico modificado por DBCO (HA) e alginato (ALG) para alcançar células funcionalizadas da superfície celular. Imagens de fluorescência confocal de células progenitoras hepáticas funcionalizadas com ácido hialurônico (HA) e alginato (ALG) mostrado no canto inferior direito. Barra de escala = 50 mm.
Uma das principais razões para o uso de MOE em relação a outros métodos de modificação da superfície, como a camada iônica por deposição de camadas ou inserção da membrana hidrofóbica, é que o MOE pode obter uma ligação covalente robusta de maneira altamente específica e biocompatível. Consideramos a ligação covalente um fator importante em nossas aplicações, pois poderia resistir a tensões potenciais de cisalhamento no parto. Além disso, adotamos essa estratégia em reconhecimento da natureza transitória das funcionalidades exógenas na superfície celular, que são progressivamente perdidas devido à remodelação ativa da membrana e rotatividade de glicano. De fato, demonstramos que os revestimentos de ALG e HA foram totalmente perdidos dentro de um período de ~ 3 dias (Fig. 2). Essa tela transitória é vantajosa nas aplicações de terapia celular, em que as funcionalidades anexadas podem ser posteriormente limpas após a adesão inicial, permitindo que as células voltem aos seus fenótipos funcionais nativos.
Figura 2. Imagens de microscopia de fluorescência confocal de HPCs em meios de cultura de células padrão após revestimento com ha (um) e alg (b) capturado por um período de 96 h. Barra de escala = 20 µm.
Depois de estabelecer um método para revestimentos de superfície robustos e de célula única, então investigamos como essas modificações podem influenciar a adesão celular a superfícies fisiologicamente relevantes, começando com substratos de matriz extracelular (ECM), progredindo para 2D endotelial e 3d in vitro Modelos de fígado. Inicialmente, antecipamos diferenças sutis entre o ALG e o HA, mas encontramos contrastes impressionantes entre os dois biomateriais funcionais. As células revestidas com HA mostraram níveis aumentados de adesão e também mostraram características morfológicas pronunciadas da adesão (ou seja Reworking de membrana ativa indicada por espalhamento e saliências) nas superfícies da ECM e nas monocamadas HUVEC 2D, provavelmente como resultado das interações funcionais nativas do HA. De fato, isso apóia estudos anteriores nos quais a regulação positiva de sintetas endógenas de HA levou a fenótipos semelhantes; Ver esse comportamento celular induzido não geneticamente foi validado e emocionante em nossos esforços. Por outro lado, as células revestidas com ALG responderam da maneira oposta, permanecendo arredondada e exibindo uma propagação reduzida, apesar de estar exposta aos mesmos ambientes. Suspeitávamos que isso fosse devido à formação de uma camada de alginato relativamente rígida na superfície celular, causada por CA2+-A reticulação mediada na superfície celular, envolvendo efetivamente as células em uma concha de hidrogel fina e impedindo a interação celular com o ECM e as superfícies endoteliais.
As integrinas são as proteínas da superfície primária envolvidas na adesão celular, então queríamos entender como a ligação desses biopolímeros afeta a expressão da integrina após o revestimento. Através da RT-qPCR, observamos algo inesperado, mas promissor para nossa aplicação. As células revestidas mostraram uma ampla regulação positiva nas subunidades da integrina, a saber α1, α2, α5, α6, αv e β3, β4, β5. À primeira vista, pensamos que isso pode ter sido devido à variabilidade técnica ou biológica, no entanto, experimentos repetidos confirmaram uma tendência consistente. Nossa hipótese anterior de reticulação de alginato na superfície celular nos levou a explorar a literatura em torno da mecanobiologia, suspeitando que os revestimentos estavam modulando ativamente como as células sentem seu ambiente. O aumento da expressão gênica de tais subunidades alinha com as vias mecanotransducivas induzidas por rigidez conhecidas, sugerindo que a presença de biopolímeros amarrados covalentemente pode sensibilizar as células a forças mecânicas que as células nativas e não revestidas não costumavam perceber. Embora os mecanismos moleculares detalhados ainda precisem ser explorados, nossos resultados sugerem um papel duplo para nossa estratégia, na qual os revestimentos desempenham um papel ativo na adesão, enquanto também as células iniciantes para pós-transplante de enxerto mediado por integrina.
Após o comportamento adesivo promissor das células revestidas com HA nos modelos 2D, exploramos se esses efeitos se traduziriam em condições fisiologicamente relevantes. Nosso objetivo foi simular as condições que as células transplantadas enfrentam durante a enxerto in vivo incorporando o fluxo dinâmico e as microtissuras específicas do fígado em nosso modelo. Para esse fim, usamos um chip de fluxo microfluídico baseado em gravidade desenvolvido por nossos colaboradores no Insphero AG, no qual as microtissuras hepáticas humanas do 3D Perception ™ foram usadas como modelo para o parênquima hepático (Fig. 3A). Após 9 h de fluxo, as células revestidas mostraram um aumento de quase 4 vezes na adesão de células revestidas com HA em comparação com controles não revestidos (Fig. 3b).
Figura 3. Representação esquemática do Insphero AkuraTm Chip imuneflow usado para o estudo de enxerto de HPCs revestido em HLMTs sob fluxo induzido por gravidade. b. Imagens de fluorescência confocal representativa de HPCs não revestidos e funcionalizados com HA (verde) enxertados em HLMTs após 3 h e 9 h de incubação sob fluxo contínuo. Barra de escala = 100 µm
Com esses resultados, uma questão crítica que se seguiu foi se a melhoria da adesão pode comprometer inadvertidamente a função celular. Encorajantemente, demonstramos que os HPCs revestidos mantiveram sua capacidade de diferenciação, evidenciada pela função fenotípica após a diferenciação induzida por Wnt. No geral, os achados deste estudo demonstram essa abordagem como um método viável para melhorar a ligação terapêutica das células, abrindo possibilidades emocionantes de tradução para outros tipos de células e usando novos materiais funcionais para desenvolver terapias celulares da próxima geração.
Para ler nosso artigo completo com mais detalhes, siga este hyperlink: ‘Doce e pegajoso: aumento da adesão celular através da funcionalização mediada por cliques de células progenitoras regenerativas do fígado‘
