Escolhendo um ensaio de repórter da luciferase: um guia fácil

Os ensaios repórter da luciferase são ferramentas essenciais na biologia molecular e celular, oferecendo meios sensíveis e quantitativos para estudar expressão gênica, regulação transcricional, vias de transdução de sinal e respostas celulares a vários estímulos.

Com vários repórteres da luciferase e reagentes de detecção disponíveis, como você sabe qual deles atende às suas necessidades específicas de fluxo de trabalho ou leitura?

A escolha de um repórter e um sistema de detecção que se alinha com seus objetivos experimentais ajuda a adaptar seu ensaio de repórter da Luciferase para obter os resultados mais significativos.

Este guia para escolher um ensaio de repórter da Luciferase o ajudará a navegar pelas opções e considerações importantes.

Entenda suas opções de repórter da luciferase

Luciferases são enzimas que produzem bioluminescência Através da oxidação de um substrato, a emissão de luz que pode ser medida usando um luminômetro.

Promega oferece três repórteres primários da luciferase, cada um com características distintas: Firefly luciferase, Nanoluc® luciferase (projetado para a luciferase de camarão profundo) e Renilla Luciferase.

Cada repórter da luciferase tem vantagens únicas e a escolha depende de fatores como tamanho, brilho e compatibilidade com o ambiente extracelular. Consulte a Tabela 1 abaixo para comparar suas principais propriedades.

Tabela 1. Resumo dos repórteres da luciferase e suas principais propriedades. *Versões desestabilizadas disponíveis para uma resposta mais rígida à transcrição. ** Versões secretadas disponíveis.

Considere os reagentes de detecção

A estabilidade do sinal, ou a meia-vida do sinal luminescente, é outra consideração crítica, pois pode influenciar seu fluxo de trabalho de processamento de amostra.

Normalmente, para um determinado repórter, a estabilidade e a intensidade do sinal estão inversamente relacionadas, com níveis mais progressivamente decrescentes de brilho inicial observados com os respectivos aumentos na meia-vida do sinal.

Por exemplo, o ensaio Twin-Luciferase® Reporter (DLR®) produz um sinal brilhante com alta sensibilidade, mas os sinais que se deterioram rapidamente-a luciferase da foguete cai 50% em cerca de 12 a 15 minutos e Renilla Luciferase em menos de 3 minutos – tornando -se necessário ler amostras imediatamente, geralmente uma de cada vez ou usar luminúmetros com injetores de reagente.

Por outro lado, o ensaio Twin-GLO® fornece luminescência estabilizada com meias-vidas de aproximadamente 2 horas de sinal para ambos os repórteres, permitindo o processamento e a compatibilidade do lote com leitores de placas multiwell sem injetores.

No entanto, a intensidade do sinal para ambos os repórteres diminui quando comparada ao ensaio DLR®. Ao parar a luciferase do Firefly com o repórter Nanoluc Brilliant, o sistema repórter Nano-GLO® Twin-Luciferase® (NANODLR) fornece a estabilidade do sinal observada com o sistema Twin-Glo, com aumento da intensidade do sinal para ambos os repórteres.

Este design aprimorado supera a troca de brilho vista com o Twin-Glo®, introduzindo Nanoluc®, que é mais de 1000 vezes mais brilhante do que Renillae, ao melhorar a química da luciferase do Firefly-resultando em um ensaio mais robusto com sinais estáveis ​​e de alta intensidade.

Comparação de duração do sinal do ensaio luciferase

A Tabela 2 mostra como os sistemas de detecção da luciferase da Promega se comparam na duração, intensidade e compatibilidade do fluxo de trabalho – para que você possa identificar rapidamente o que atenda às suas necessidades.

Tabela 2. Comparação de sistemas de detecção de luciferase da Promega lítica. * Fluc refere -se à luciferase de Firefly; Rluc refere -se a Renilla luciferase.

Considere a complexidade do protocolo

Também é importante avaliar a complexidade do protocolo de ensaio. Os ensaios não homogêneos envolvem uma etapa adicional para criar um lisado antes de adicionar o reagente de detecção, que pode estender o tempo de ensaio e introduzir variabilidade.

Por outro lado, os ensaios homogêneos simplificam o fluxo de trabalho, permitindo a adição direta do reagente às células em cultura, eliminando a necessidade de pré-processamento da amostra.

Você precisa de um sistema de detecção de células líticas ou de células vivas?

Considere se você precisa de um sistema de detecção de repórter de células vivas ou de células vivas.

Enquanto esta postagem do weblog se concentra em ensaios líticos, os formatos de luciferase de células vivas para Nanoluc® e Renilla Os repórteres também estão disponíveis para apoiar análises em tempo actual e longitudinal.

Você precisa de um repórter único ou duplo?

Considere também se o seu experimento requer detecção de repórter único ou duplo, o último dos quais pode ser usado para normalização do ensaio ou para medir duas respostas biológicas distintas em paralelo.

Escolhendo um ensaio de repórter da luciferase

A adaptação da sua seleção com base nos fatores acima ajudará a garantir um ensaio de luciferase que se alinhe em estreita colaboração com seus objetivos experimentais.

O Promega oferece químicas de detecção com uma ampla gama de durações de sinal – de ensaios flash de alta sensibilidade como o Sistema de ensaio luciferase para brilhar sistemas de formato como Brilliant-Glo ™ Sistema, One-Glo ™ Ex Sistema, Regular-GLO® Sistema e Nano-GLO® Sistema.

Para explorar e comparar as características do ensaio da luciferase e encontrar o melhor ajuste para o seu próximo experimento, visite o Promega’s Guia de seleção de ensaio luciferase.