Choque osmótico para melhor expressão de proteínas

Seu campo de pesquisa parou porque você está preso tentando expressar uma proteína insolúvel? Você pode expressar e purificar essa proteína, mas não pode demonstrar sua atividade?

Tenho duas palavras que podem ajudá -lo: choque osmótico. Proceed lendo para descobrir como essa técnica pode levá -lo de volta ao caminho para uma pesquisa bem -sucedida de proteínas.

O que é choque osmótico?

Expondo células bacterianas a altas concentrações externas de osmólitos (pequenos e solúveis compostos que regulam o quantity celular) retardam o crescimento e a divisão celular. Isso ocorre porque as células perdem água para o meio de crescimento através osmoseresultando no chamado choque osmótico. (1)

O choque não é letal, e as células eventualmente se equilibram, sintetizando e absorvendo seus próprios osmólitos. Isso evita a perda de água e permite que as células continuem crescendo e se dividem (Figura 1). Em E. colio host mais comum para expressão de proteínasesses osmólitos incluem potássio, glutamato e trehalose.

Como o choque osmótico aumenta a solubilidade e a atividade das proteínas expressas?

Em suma, ninguém sabe ao certo. A teoria com mais evidências para isso é o chamado Osmofóbicos teoria. (2) afirma que as interações químicas entre o osmólito e o spine da proteína alvo são energeticamente desfavoráveis. Presume -se que essas interações sejam menos prevalentes quando a proteína é dobrada; portanto, a forma nativa e presumivelmente ativa é promovida in vivo durante a expressão.

Voltar à realidade: como realizar choque osmóticos

Tudo isso é bom e bom, mas como você aplica essa técnica?

Bem, é simples. Adicione 500–1000 mm D-sorbitol ao seu Mídia de crescimento bacterianoe prossiga como sempre. (3) Ah, e não se preocupe em dissolver todo esse pó, ele desaparecerá magicamente na autoclave.

Outro estudo relatou que a inclusão de 2,5 mm de betaína de glicil, além do D-Sorbitol, melhora ainda mais os resultados, proporcionando um aumento de 427 vezes na atividade da amostra de teste, para que você possa tentar isso também. (4)

Você também pode variar a concentração de NaCl do meio escolhido, pois o NACL é um osmólito. Comparar quaisquer mudanças em rendimento de expressão e atividade alvo contra uma expressão de controle e POW! Felizmente, você obtém excelentes resultados.

Sempre há uma desvantagem

Há uma desvantagem com esta pequena jóia de uma técnica. Ao sintetizar e absorver osmólitos extras, as células experimentam uma carga metabólica significativa. Como resultado, eles crescem e se dividem lentamente. Realmente. Realmente. Devagar. Por esse motivo, você estará esperando muito tempo para que suas culturas bacterianas atinjam uma densidade óptica na qual é apropriado induzir a expressão da sua proteína alvo.

Você pode superar isso até certo ponto, incluindo os osmólitos em sua cultura de pequeno quantity que você reinocula nas culturas de grande quantity antes da expressão. Como a cultura de pequeno quantity geralmente é deixada durante a noite, as células podem equilibrar-se às condições de choque osmóticas enquanto você está dormindo alegremente.

Se você é novo em todo esse materials de expressão de proteínas e esses termos são um pouco confusos, verifique isso Excelente artigo sobre densidade óptica e Este guia para expressão de proteínas.

Mesmo assim, esteja preparado para esperar duas ou três vezes mais que faria na ausência de osmólitos e ainda mais se estiver selecionando para vários plasmídeos com múltiplos antibióticos.

O choque osmótico funcionou para você? Descobriu algum osmólitos adicionais que ajudaram sua proteína expressa? Certifique -se de deixar um comentário abaixo se sim.

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Referências

1. Yancey Ph (2001) Estresse hídrico, osmólitos e proteínas. Sou zool 41: 699-709
2. Bolen DW e Baskakov IV (2001) O efeito osmofóbico: seleção pure de uma força termodinâmica na dobragem de proteínas. J Mol Biol 310: 955-63
3. Oganesyan n et al. (2007) Efeito do estresse osmótico e choque térmico na superexpressão e cristalização de proteínas recombinantes. Proteínas Expr Purif 52: 280–5
4. Blackwell Jr e Horgan R (1991) Uma nova estratégia para a produção de uma proteína recombinante altamente expressa em uma forma ativa. Febs lett 295: 10–2

Eu tenho um mestrado em química e um doutorado. em biologia estrutural. Estou interessado em como a forma e a conectividade das moléculas se relacionam com sua reatividade e função.