Muitas vezes, o projeto ou doutorado terminou, e o artigo publicou, e ainda assim a história inacabada. Durante o curso do doutorado, há muitas observações misteriosas e perguntas não respondidas.
Meu trabalho de doutorado foi publicado ano passadoonde descrevemos o papel da CPH (cronofágo) no comportamento locomotor de Drosophila. Relato aqui uma observação que não é completamente explicada pelo nosso entendimento atual do desenvolvimento neural em Drosophila.
Surpresas em nosso caminho: Quando eu comecei meu doutorado, com o Prof. Unendra Nongthomba no Instituto Indiano de Ciência, Bengaluru, este gene Cph foi apenas um número (CG9650). Onde procurar a função desse gene desconhecido? O projeto foi um desafio, e jogou algumas surpresas em nosso caminho.
Primeiro, a única evidência de que esse gene pode ter um papel no desenvolvimento neural (e, portanto, nosso interesse por ele) veio de uma tela de expressão incorreta. Essa tela mostrou que a expressão pan-neural desse gene IE em todos os neuroblastos e glia causou defeitos de orientação axônicos. Isso ocorreu devido à sua expressão em neuroblastos/glia, exceto aqueles em que normalmente expressa? Foi o que pensamos – célula errada, tempo errado. Os defeitos eram graves o suficiente para causar letalidade embrionária.
No entanto, após o knockdown desse gene em neuroblastos, ou glia ou neurônios, não vimos nenhum defeito de orientação do axônio, ou letalidade embrionária. O knockdown nos neurônios resultou em moscas que tremiam constantemente, de curta duração e falharam em se reproduzir.
Movimento regular da moscaMovimento de moscas knockdown de CPH
O segundo desafio foi para entender o defeito comportamental. Primeiro, pensei que o tremor constante dessas moscas period devido a convulsões. Solicitei informações de especialistas – o falecido Prof. KS Krishnan (Centro Nacional de Ciências Biológicas, Bengaluru, Índia) e o Prof. Dan Kuebler (Universidade Franciscana de Steubenville, Ohio, EUA). Krishnan me pediu para fazer um vídeo de maior ampliação. (Infelizmente ele faleceu antes que pudéssemos chegar a uma conclusão). Dan Kuebler, especialista em epilepsia em Drosophila, disse que o tremor não parecem convulsões para ele.
Ocorreu -me que as moscas que estão de costas e continuam tremendo talvez estejam tentando se levantar. A maioria deles não conseguiu se levantar e, mesmo que o fizessem, cairiam em segundos. Portanto, o tremor foi devido a um defeito motor, e não às convulsões. Os registros eletroológicos também apoiaram isso – picos espontâneos aberrantes indicativos de convulsões estavam ausentes. (No entanto, eles mostraram sensibilidade ao bang, ou seja, quando submetidos a um choque mecânico, eles entraram em paralisia. Isso é visto principalmente em genótipos suscetíveis de convulsões. Assim, a suscetibilidade às crises não pode ser descartada em Cph animais de knockdown.)
A observação desconcertante: Perguntamos – em que estágio de desenvolvimento esse gene period necessário? Surpreendentemente, o knockdown desse gene em adultos não teve nenhum efeito! O knockdown durante o estágio larval reduziu a atividade locomotora nessa fase, mas aboliu a atividade locomotora em adultos.
Efeito de Cph Knockdown em diferentes estágios de desenvolvimento: Cph foi derrubado durante diferentes estágios, e as moscas resultantes foram avaliadas pelo tempo gasto na vertical.
Os animais foram criados inicialmente a 18 ° C e depois mudaram para 29 ° C em diferentes estágios de desenvolvimento. Mudança Cph Os animais knockdown no estágio embrionário ou L1 resulta em moscas com defeitos locomotores. A mudança dos animais após o estágio L3 resulta em moscas com atividade locomotora regular.
E, embrião; L1, primeiro ínstar larval; L3, terceiro ínstar larval; P1, Pupa precoce (menos de 30 horas); P2, pupa tardio (70-90 horas); A, adulto
Os animais foram criados inicialmente a 29 ° C e depois mudaram para 18 ° C em diferentes estágios de desenvolvimento. Mudança Cph Os animais knockdown no estágio embrionário ou L1 resulta em moscas com atividade locomotora regular. A mudança do estágio pós -L3 resulta em moscas com defeitos locomotores.
Como isso poderia ser explicado? Se essa proteína expressa em células -tronco neurais larvais, uma possível explicação poderia ser alcançada. Mas nossa observação foi o resultado do knockdown nos neurônios! Como a atividade neuronal durante o desenvolvimento ou a falta dela afeta sua função em adultos?
Eu descrevo duas hipóteses:
Efeito na re-especificação dos neurônios primários.
Os neurônios primários são os nascidos durante a primeira fase das divisões de neuroblastos no embrião. Esses neurônios funcionam durante o estágio larval e são reconfigurados para se conectar a novos alvos para funcionar durante o estágio adulto. Durante a remodelação neuronal que ocorre durante a metamorfose, os processos neuronais são retirados dos alvos larvais e novos axônios e dendritos se formam em direção a alvos específicos para adultos. Essa re-especificação dos neurônios primários pode ser afetada se seu funcionamento durante o estágio larval causasse mudanças irreversíveis neles.
No caso de neurônios motores, as alterações plásticas dependentes da atividade durante o estágio larval podem afetar a morfologia da junção neuromuscular, e esse efeito pode persistir durante o estágio de remodelação.
Efeito do estado energético na formação/função dos neurônios secundários
Os neuroblastos embrionários inativos, pós -ativação nas larvas do primeiro ínstar, passam por outra rodada de proliferação. Esta fase das divisões de neuroblastos produz as linhagens neuronais secundárias que funcionam no cérebro adulto. A reativação e a divisão subsequente desses neuroblastos inativos dependem de um sinal do corpo gordo, que por sua vez depende do estado nutricional do animal (Chell e Model 2010; Sousa-Nunes et al. 2011). Não se sabe se o estado nutricional também afeta a diferenciação dos neurônios.
A função de sinapse é um processo intensivo em energia. O ATP é necessário para o transporte axonal, fusão de vesículas, captação de neurotransmissores and many others. Animais com PGK reduzido (fosogliceracerkinase), uma enzima necessária para a geração de ATP, mostra defeitos locomotores no estágio larval e adulto (Wang et al. 2004). Foi demonstrado que a deficiência de PGK em seres humanos causa convulsões, miopatia e fadiga muscular (Tsujino, et al. 1995), (DiMauro, Dalakas et al. 1983). A metamorfose que segue o estágio larval ocorre usando a energia armazenada durante esse estágio. A metamorfose é desencadeada pela liberação de ecdisona, que ocorre apenas após a adquirida nutrientes suficientes para sobreviver à metamorfose (Di Cara e King-Jones 2013). No entanto Cph Os animais knockdown provavelmente adquirem energia suficiente para sobreviver à metamorfose, seu desenvolvimento neuronal durante esta fase pode ser comprometido.
Eu gostaria de receber outras idéias ou sugestões.
Referências:
Chell, JM e AH Model (2010). “Controle da glia responsiva à nutrição Saída de células-tronco neurais da quiescência”. Cell 143 (7): 1161-1173.
Sousa-Nunes, R., LL Yee, et al. (2011). “As células adiposas reativam os neuroblastos quiescentes by way of TOR e relés de insulina glial em Drosophila.” Nature 471 (7339): 508-512.
Wang, P., S. Saraswati, et al. (2004). “Um mutante de convulsão sensível à temperatura de Drosophila na fosfogliceridade quinase interrompe a geração de ATP e altera a função sináptica”. J Neurosci 24 (19): 4518-4529.
Tsujino, S., S. Shanske, et al. (1995). “Heterogeneidade genética molecular da deficiência de fosfogliceridade quinase (PGK).” Suprimento do nervo muscular 3: S45-49.
DiMauro, S., M. Dalakas, et al. (1983). “Deficiência de quinase da fosfogliceridade: outra causa de mioglobinúria recorrente”. Ann Neurol 13 (1): 11-19.
Di Cara, F. e Ok. King-Jones (2013). “Como os relógios e os hormônios agem em conjunto para controlar o momento do desenvolvimento de insetos.” Curr Prime Dev Biol 105: 1-36.
