A fluorescência é uma das ferramentas mais importantes e úteis na caixa de ferramentas de um biólogo. Na biologia, quase todos os campos, da fisiologia à imunologia, usa moléculas fluorescentes (também conhecidas como fluoróforos) para detectar proteínas. No entanto, a ciência específica por trás de como a fluorescência funciona pode ser confusa ou esquecida.
Não tem medo! Neste artigo, quebramos os principais pontos de fluorescência para que você possa ser o especialista que sempre quis.
O que exatamente é a fluorescência?
Por definição, a fluorescência é um tipo de fotoluminescência, que é o que acontece quando uma molécula é excitada por fótons de luz ultravioleta ou visível. Mais especificamente, a fluorescência é o resultado de uma luz de absorção de moléculas em um comprimento de onda específico e emitindo luz em um comprimento de onda mais longo.
Detalhes, por favor
Felizmente, este tópico é o que o Dr. Aleksander Jablonski dedicou sua vida. Ele finalmente desenvolveu o diagrama Jablonski para descrever a absorção e emissão da luz. Em suma, as três etapas de fluorescência são absorção (ou excitação), transição não radiativa (ou vida útil do estado excitado) e emissão de fluorescência.1
Etapa 1: Excitação
Flashback da química geral: a luz visível existe como partículas elementares chamadas fótons. Essas partículas são pacotes essenciais de energia que, quando absorvidos, impulsionam ou “excitam” a molécula de absorção de luz em um nível de energia mais alto. No caso de fluorescência, os fluoróforos absorvem a luz visível, geralmente fornecida de uma lâmpada ou laser incandescente, levando a um estado de singlete eletrônico excitado (s1) da molécula.
Etapa 2: Lifetime de estado excitado
Como todos sabemos, o objetivo de um átomo é estar no estado mais baixo possível de energia. Portanto, quando um fluoróforo está entusiasmado com um estado eletrônico mais alto, ele imediatamente quer começar a liberar energia; Assim, esse estado excitado, conhecido como a vida útil do estado excitado, não dura muito tempo (normalmente 1 a ten nanossegundos). Mesmo assim, essa etapa no processo é incrivelmente importante, pois é durante esse período que o energia de s1 Começa a se deter.
Etapa 3: Emissão
E, finalmente, estamos prontos para alguma fluorescência! Começando no estado excitado “relaxado”, o fóton de alta energia decai rapidamente em direção ao estado basic e emite esse excesso de energia como fóton de luz. Essa transição de energia é o que conhecemos como fluorescência. Curiosamente, como parte dessa energia já foi liberada durante a vida útil do estado excitado, a energia do fóton agora fluorescente é menor que a energia do fóton de excitação. Assim, a energia liberada durante a fluorescência sempre terá um comprimento de onda mais longo do que o necessário para a excitação.
Como a citometria de fluxo aproveita as moléculas fluorescentes?
Nós cobrimos o conceito e básico de citometria de fluxo em artigos anteriores e um webinar, então volte e refresque -se sobre o assunto, se necessário.
Preparar? Vamos!
Ao lidar com moléculas fluorescentes, precisamos prestar atenção especial à diferença entre os comprimentos de onda ou energia de excitação e emissão, também conhecidos como o Stokes Shift. O significado da mudança de Stokes está em sua simplicidade: nos permite determinar se o comprimento de onda da luz emitida e o comprimento de onda da luz de excitação são grandes o suficiente para diferenciá -los com segurança. Como a leitura da citometria de fluxo é baseada apenas na fluorescência, é essencial estar ciente desse parâmetro ou gerar risco de gerar dados emoji de cocô não confiáveis.
Além disso, é extremamente importante acompanhar o espectro de absorção e o espectro de emissão para cada fluoróforo e como vários lasers podem interagir com o fluoróforo em questão. Por exemplo, em um citômetro de fluxo, o laser de íons argônio emite luz de 488 nm, que excita o fluoróforo, isotiocianato de fluoresceína (FITC). Como o 488 nm está muito próximo do máximo de absorção do FITC, a excitação resulta em alta emissão de FITC. No entanto, se o FITC estiver excitado por outro comprimento de onda de um laser diferente dentro de seu espectro de absorção, Emite luz no mesmo espectro, mas não é da mesma intensidade.
E aí está: uma rápida introdução/lembrete de fluorescência e como ela se relaciona com moléculas fluorescentes utilizadas na citometria de fluxo. Questões? Comentários? Deixe -nos saber!
Referências
- Llères et al., 2007. Detectar interações proteína-proteína in vivo com FRET usando microscopia de imagem por vida útil da fluorescência multifóton (FLIM). Protocolos atuais em citometria. Capítulo 12: Unidade12.10. doi: 10.1002/0471142956.cy1210s42.
Ouça o Nobel Laureate Martin Chalfie Os microscopistas Podcast e descubra mais sobre seu envolvimento na descoberta e desenvolvimento da GFP:
