Madalena M. Reimão Pinto (Schier Lab, Universidade de Basileia, Suíça) e Sebastian Castillo Hair (Seelig Lab, Universidade de Washington, Seattle, EUA) uniram forças para entender como os embriões de peixe -zebra orquestram a síntese de proteínas durante o desenvolvimento precoce. Através desta colaboração, seu estudo recentemente publicado em Célula de desenvolvimento Identifica características nos UTRs do mRNA 5 ‘que atuam durante o desenvolvimento inicial do peixe -zebra para common a tradução.
Madalena, o que o levou ao laboratório de Alex Schier e como você embarcou neste projeto?
Durante meu doutorado no Viena Biocentro, trabalhei para entender os mecanismos moleculares que regulam a biogênese do mRNA e a função na mosca da fruta. Aconteceu que a enzima exonucleolítica em que eu estava trabalhando na época teve um efeito impressionante na espermatogênese, e os dados apontaram para defeitos resultantes da tradução do mRNA indevida. No last do meu doutorado, fiquei fascinado com o controle translacional do mRNA no contexto do desenvolvimento organismal. Eu rapidamente percebi que não tínhamos uma compreensão abrangente de como o início da tradução do mRNA-que é a taxa de limitação da produção de proteínas-é regulada durante os estágios muito acelerados e coordenados temporalmente da embriogênese precoce. Isso me motivou a abordar essa questão no contexto do desenvolvimento precoce dos vertebrados. Também percebi que minha formação em bioquímica de RNA me deu uma vantagem para começar a estudar a biologia do desenvolvimento em um nível mecanicista de uma perspectiva diferente. Eu escolhi abordar essa questão usando o modelo de peixe-zebra, porque ele me permite combinar abordagens de alto rendimento com bioquímica e poderosas ferramentas genéticas em embriões vivos, à medida que se desenvolvem.
Eu tinha ouvido grandes coisas sobre o laboratório Schier de Andi Pauli (Alumna Schier Lab, líder de grupo do Viena Biocenter, Áustria) e fui inspirado pelo trabalho de Michal Rabani sobre a estabilidade do mRNA durante o embriogênese do peixe -zebra (Schier Lab Alumna, líder de grupo da Universidade Hebrew de Jerusalem, Israel). Por um lado, eu estava procurando ingressar em um laboratório que tinha conhecimento profundo sobre a biologia do desenvolvimento e a genética do peixe -zebra; Por outro lado, eu queria fazer parte de um grupo multidisciplinar e vibrante de pessoas que aspiravam a se tornar líderes de grupo, então o laboratório Schier period a escolha perfeita.
A principal pergunta que motiva meu trabalho de pós -doutorado é: como os embriões sabem quanta proteína fazer e quando? Para começar a dissecar essa pergunta sistematicamente, decidi me concentrar na sequência de 5 ‘UTR, que é essential para regulamentar o início da tradução, e desenvolvi uma abordagem para interrogar na escala do transcriptoma como o UTR 5’ contribui para common a dinâmica translacional à medida que os embriões se desenvolvem.
Madalena segurando um tanque de peixe -zebra. Crédito da foto: Annette Roulier, Biozentrum Basel.
Como começou a colaboração com o Laboratório Seelig?
Bem, levou mais de dois anos para chegar a um estágio quando eu havia projetado e gerado a biblioteca de reportações de 5 ‘UTR paralela (MPRA), validou -a e adquiriu o in vivo dados. Para ser sincero, também passei algum tempo executando análises de dados antes de me convencer de que o ensaio realmente havia funcionado e estava recuperando informações biologicamente significativas! Depois que percebi que period o caso, fiquei tremendous empolgado em tentar aprender o máximo possível com os dados. Eu estava familiarizado com o trabalho de Georg Seelig e realmente o conheci pessoalmente quando ele deu uma palestra no seminário de descoberta do Biozentrum. Naquela época, eu ainda estava executando experimentos, mas me aproximei de Georg e perguntei se ele estaria interessado em colaborar para explorar os dados com modelos de aprendizado profundo. Georg estava empolgado com o meu projeto e me disse para chegar quando chegou a hora certa, e eu o fiz! Ele então me combinou com Sebastian e começamos uma colaboração maravilhosa juntos. Honestamente, foi tão eficiente e muito divertido: nos encontraríamos a cada duas semanas e, a cada reunião, discutiríamos nosso progresso, chegávamos a um acordo sobre as próximas análises e experimentos e depois os executam. Isso deu ao projeto um momento muito bom e foi ótimo sentir parte de uma equipe trabalhando em direção a um objetivo comum. Ao mesmo tempo, Georg ingressou no Schier Lab para um sabático, por isso foi ótimo ter a oportunidade de discutir e obter suggestions regularmente de ambos os PIs pessoalmente. O projeto não teria sido o mesmo sem as contribuições de Sebastian, que desenvolveram o Danio Optimus 5-Prime (DANIO5P) Modelo de aprendizado profundo para avaliar e interpretar os dados 5 ‘UTR MPRA. E Georg foi quem criou o nome do modelo!
O que foi para você as descobertas mais emocionantes ou momentos específicos durante o projeto que ficou com você?
O momento mais emocionante foi executar a sequência de Kozak e as análises do UORF e perceber que o ensaio havia realmente funcionado tecnicamente. Isso também significava que os dados provavelmente continham informações de sequência adicionais a serem descobertas, o que period uma perspectiva tremendous emocionante. E então, é claro, vendo motivos emergindo da análise de enriquecimento de motivos e do modelo Danio5p!
Eu também gostaria de dizer que, quando iniciei esse projeto, não tive experiência em realizar perfis de polissomo. Tive a sorte de conhecer Sunil Shetty, na época um pós -doutorado no Corridor Group no Biozentrum (agora liderando seu grupo de pesquisa independente no Tata Memorial Middle em Mumbai, na Índia), que me ensinou a preparar gradientes de sacarose e realizar perfis de polissomo. Sua felicidade e positividade são contagiosas, e alguns dos momentos mais divertidos do meu pós -doutorado foram gastos ao lado do aprendizado de máquinas de perfil de polissomo com Sunil. Sou profundamente grato a ele, e também a Michael Corridor por me receber gentilmente em seu laboratório.
E o que foi mais desafiador?
Com certeza, estava iniciando meu pós-doutorado e tendo a pandemia Covid-19 atingida alguns meses depois. Na época, meu plano period definir experimentalmente o Zebrafish 5 ‘UTRS por sequenciamento de leitura longa para projetar o MPRA. Havia tanta incerteza sobre quando poderíamos estar de volta ao laboratório em tempo integral, que decidi usar uma abordagem alternativa para inferir computacionalmente sequências UTR de 5 ‘a partir de um conjunto de dados público da análise CAP dos dados de expressão gênica. Não tenho experiência em biologia computacional, por isso foi definitivamente um processo de aprendizado lento e iterativo – mas também muito gratificante no last, e o mais importante é que me permitiu avançar com o projeto.
O que está por vir para você?
Atualmente, estou me candidatando a cargos de líder de grupo. Fazer entrevistas e encontrar membros do corpo docente de diferentes instituições de pesquisa é realmente uma experiência incrível e gratificante, mas também muito demorada, por isso é difícil realizar experimentos juntamente com aplicativos e entrevistas. Estou tremendous empolgado em iniciar meu próprio grupo de pesquisa independente em breve e espero continuar a colaborar com Sebastian em projetos futuros!
Montagem de imagens de embriões de peixe -zebra adquiridas em estágios consecutivos de desenvolvimento (de 2 a ten horas após a fertilização) que foram injetados em O estágio de 1 célula com um corante dextrano fluorescente (magenta) e um mRNA Repórter que codifica GFP (verde), relembrando as fases da lua.
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