Os inibidores de protease são amplamente utilizados em laboratórios de biologia molecular. Proceed lendo para descobrir por que eles são necessários, como usá -los com segurança e como armazená -los corretamente.
Proteases problemáticas
As proteases estão presentes em todos os organismos vivos. Eles quebram ligações peptídicas nas proteínas e estão envolvidas em uma infinidade de processos e vias celulares, variando de simples a complexo.
Sem eles, Seu sangue não coagula. A apoptose, o processo pelo qual as células se transformam em condições normais, deixariam de ocorrer. A pepsina e a tripsina deixariam de nos ajudar a digerir refeições saborosas cheias de proteínas.
Pior de tudo é que você pode não conseguir tirar manchas de suas roupas, porque as proteases são um aditivo comum em muitos Detergentes da lavanderia (suspiro)!
Todas as brincadeiras de lado, as proteases são claramente essenciais para as células funcionarem normalmente. Tudo isso é bom e bom para a vida como o conhecemos, mas Proteases podem ser uma grande dor no pescoço Quando se trata de proteínas de expressamento e purificação no laboratório.
Sempre que você lisou as células, a compartimentação e a inibição que mantêm as proteases nativas sob controle são quebradas, e você desencadeia um engajamento potencial em suas preciosas proteínas de interesse.
Por que as proteases são um problema durante a lise celular?
Lise celular interrompe as membranas, incluindo aquelas que sequestram proteases, que são cuidadosamente mantidas sob controle pela célula durante o metabolismo regular. Depois que a barreira é perdida, quaisquer que sejam as proteases que sua linha celular expressa seja livre para começar a trabalhar no restante das proteínas livres em solução.
Adicionar inibidores de protease como um componente do tampão de lise significa que você pode ter uma medida preventiva pronta para ir mesmo antes de as membranas celulares serem rompidas durante o processo de lise.
Mesmo se você não conhece a diversidade de inibidores de protease que existem, é provável que você tenha usado pelo menos um ou dois deles se lise celular é uma parte típica do seu trabalho (estou olhando para você, EDTA!).
Agora sabemos por que as proteases são necessárias, vamos analisar como elas funcionam.
O que são inibidores de protease e como eles funcionam?
Os inibidores de protease não são uma família de moléculas relacionadas pela estrutura. Em vez disso, os inibidores da protease são definidos por sua função: eles inibem proteases, como o nome implica.
Tecnicamente falando, os inibidores da protease incluem quaisquer compostos químicos ou biológicos que se ligam a proteases para inibir sua função de reversível ou irreversivelmente. Seu tamanho e peso molecular variam amplamente, e a classificação inclui pequenos produtos químicos, peptídeos e até outras proteínas.
Os inibidores da protease podem ser classificados de várias maneiras. Ao comprar inibidores de protease, você descobrirá que eles são frequentemente agrupados pelo tipo de protease que inibem. No entanto, podemos classificá -los amplamente com base em se eles são inibidores reversíveis ou irreversíveis.
Inibidores reversíveis
UM reversível O inibidor se liga ao native ativo de uma enzima através de interações não covalentes. Um bom exemplo de inibidor de protease reversível é a aprotinina, que inibe a maioria das proteases serinas, competindo com o substrato pure do native ativo. Para que os inibidores da protease reversível funcionem bem, você deve garantir que uma concentração apropriada do inibidor seja usada para que ele possa superar efetivamente o substrato de protease pure (suas proteínas preciosas!).
Inibidores reversíveis
Por outro lado, um irreversível O inibidor se liga ao native ativo de uma maneira que impede a função permanentemente. Por exemplo, o E-64 é um epóxido que modifica covalentemente o sítio ativo cisteína envolvida no ataque nucleofílico em proteases de cisteína, tornando a protease inativada para sempre e incapaz de dividir qualquer peptídeo futuro que teria cortado.
Dentro desses dois grupos de inibidores de protease, há uma grande variedade de afinidade para várias proteases. Felizmente, os inibidores mais comuns de protease sugeriram faixas de concentração de trabalho, e seus mecanismos são bem compreendidos pela comunidade científica – tornando sua vida mais fácil quando se trata de selecionar inibidores para usar em seu trabalho!
Inibidores de protease comumente usados
Ter uma sólida compreensão de como o trabalho de inibidores de protease particular person fornece uma base firme para o seu uso, mesmo se você decidir usar um coquetel – a maioria dos quais inclui alguma combinação dos inibidores mais comuns de protease abaixo (Tabela 1).
Tabela 1. Inibidores de protease comumente usados no laboratório, seus alvos e concentrações de trabalho.
| Inibidor de protease | Alvo | Tipo | Exemplo de estoque conc. | Estabilidade da temperatura do solvente | Trabalhando conc. (1x) | Dicas e notas |
| Aebsf | Serina proteases | EU | 100 mm | H2O –20 ° C. 3 meses |
0,2-1,0 mm | Solúvel em água, diferente da maioria dos outros inibidores de protease serina
Pode modificar covalentemente certos resíduos de aminoácidos em outras proteínas; portanto, considere isso ao purificar proteínas para espectrometria de massa a jusante ou eletroforese em gel |
| Aprotinina | Serina proteases | R | 10 mg/ml | H2O –70 ° C. 6 meses |
100–200 nm | Dissocia -se de proteases em phs extremos (<3 ou> 10) |
| Bestatin | Certas amino-peptidases | R | 2–5 mg/ml | Meoh –15 a –25 ° C 6 meses |
1–10 muM | Baixa estabilidade em soluções aquosas |
| E-64 | Proteases de cisteína | EU | 1 mm | H2O – 20 ° C. 6 meses |
1–20 muM | Alta especificidade para atingir proteases e altamente solúveis em soluções aquosas |
| EDTA | Metallo-Proteases | R | 0,5 m (pH 8) |
H2O 20 ° C. 1 ano |
2–10 mm | Quelatos (e, portanto, sequestres) metais divalentes para que as metaloproteases não possam funcionar Solúvel em água e estável em soluções aquosas Não é compatível com cromatografia imobilizada de afinidade de steel (retirará o níquel das colunas de purificação!) Ou eletroforese em gel 2D |
| Leupeptina | Serina, cisteína e proteases de treonina | R | 10 mm | H2O 4 ° C. 1 semana ou -20 ° C. |
10–100 muM | Água solúvel, mas baixa estabilidade na concentração de trabalho
Pode afetar ensaios de quantificação de concentração de proteínas, como o ensaio de Bradford |
| Pepstatina a | Proteases aspárticas | R | 1 mm | DMSO –20 ° C. 6 meses |
1–20 muM | Altamente estável, mas muito baixa solubilidade na água |
| PMSF | Serina proteases | R | 1 m | DMSO –20 ° C. 6 meses |
0,1-1,0 mm | Solubilidade limitada e altamente instável em soluções aquosas. Uma neurotoxina conhecida – Exercício CUIDADO Ao usar! |
Escolhendo os inibidores certos: a importância dos coquetéis
Mas espere! Como selecionamos um único inibidor de protease de bala mágica que impedirá que todas as proteases degradam proteínas em nosso fluxo de trabalho de lise? O fato é que não há um inibidor de protease que inative todas as proteases conhecidas.
Proteases únicas são frequentemente usadas quando o objetivo é Remova tags de proteínas já purificadas. Na maioria dos outros casos em que a ação ampla contra proteases nativas é desejada, um “coquetel” de vários inibidores de protease fará o truque e é uma opção common. Esses coquetéis vêm preparados como soluções concentradas ou, às vezes, como comprimidos convenientes.
A maioria dos coquetéis disponíveis comercialmente é uma combinação de seis inibidores: AEBSF, Aprotinina, Bestatina, E-64, Leupeptina e Pepstatina A. Com a adição de EDTA, um coquetel de ação ampla) cobre quase todas as suas bases na maioria das lise de células e os trabalhos de purificação (EDTA (EDTA é sugerido.
Os coquetéis são meios especialmente convenientes, baratos e confiáveis de inibir proteases e são muito populares nos laboratórios. Consulte as folhas de dados e protocolos do seu fornecedor para decidir sobre a quantidade de um coquetel para adicionar ao seu buffer de lise.
Considerações ao usar inibidores de protease no laboratório
Abaixo estão algumas coisas a serem lembradas ao decidir usar um inibidor de protease em seu trabalho.
Armazenar
Vários inibidores de protease são especialmente instáveis quando mantidos à temperatura ambiente ou mesmo em condições refrigeradas por períodos prolongados. Além disso, a estabilidade dos inibidores da protease varia em sua concentração de trabalho (ou 1x).
Enquanto você armazenar inibidores de maneira adequada e de acordo com as direções do fornecedor, eles devem funcionar como pretendido quando você estiver pronto para usá -los. Uma exceção é o PMSF, que pode exigir várias adições para manter as proteases afastadas.
Segurança
Enquanto a maioria dos inibidores de protease é reconhecida como geralmente segura com EPP padrão de microbiologiaexistem alguns casos especiais. Alguns inibidores são preparados como concentrados em solventes orgânicos e ácido acético.
PMSF atua como uma neurotoxina e deve ser tratado em um exaustor.
Conclusão: sempre revise o Folha de dados de segurança em qualquer novo reagente que você usa no laboratórioincluindo inibidores de protease disponíveis comercialmente.
Compatibilidade com seu fluxo de trabalho
Embora vários inibidores de protease visam certas courses de proteases de maneira bastante especificamente, há casos em que você pode excluir certos inibidores que não são adequados com atividades a jusante em seu trabalho.
Por exemplo, o EDTA é um excelente inibidor de metaloprotease devido à sua capacidade de quelatar cátions divalentes que os metaloproteases requerem em seus locais ativos para catalisar a proteólise. Mas o EDTA irá também Despoja as colunas de purificação de proteínas de níquel frequentemente usadas para purificar Proteínas marcadas com His.
Outros inibidores de protease não funcionam em extremos de pH ou temperatura.
De um modo geral, você provavelmente terá um excelente começo consultando as instruções fornecidas com inibidores de protease dos fornecedores, incluindo a melhor maneira de lidar e utilizar seus inibidores de escolha.
Você usa inibidores de protease regularmente em seu trabalho ou tem dicas ou conselhos adicionais? Informe-nos nos comentários abaixo e feliz inibição!
Recursos
- O homem da proteína. Como selecionar o inibidor correto da protease. G-Biosciences. Publicado em 8 de agosto de 2017. (Acesso em 1 de novembro de 2021).
- O homem da proteína. Por que eu deveria ter um coquetel inibidor? G-Biosciences. Publicado em 1 de dezembro de 2015. (Acessado em 1 de novembro de 2021).
- Inibidores de protease e fosfatase. Thermo Fisher Scientific. (Acessado em 1 de novembro de 2021).
- O guia completo para inibição da protease. Roche Aplicou Science. (Acessado em 1 de novembro de 2021).
- Caroline Ritchie. Inibidores de protease. Labome. Publicado em 8 de agosto de 2021. (Acesso em 1 de novembro de 2021).
- Brianna Bibel. Tipos de protease, inibidores e uso do uso. Publicado em 15 de setembro de 2020. (Acesso em 1 de novembro de 2021).
