A análise da amostra está no coração da pesquisa biológica, impulsionando descobertas em genética, proteômica e desenvolvimento de medicamentos. No entanto, há uma técnica que geralmente é esquecida, apesar de já estar em muitos de nossos laboratórios.
Se você já usou um leitor de placas, já realizou espectroscopia óptica – uma técnica analítica que usa luz para avaliar amostras. Mas suas aplicações vão muito além das leituras de placa bem, desde a determinação da pureza do RNA em experimentos de PCR até a caracterização rapidamente de proteínas complexas.
Neste put up, daremos uma olhada nos princípios da espectroscopia óptica e exploraremos as muitas maneiras pelas quais ele está sendo usado na indústria biológica. Vamos começar.
O que é espectroscopia óptica?
A espectroscopia óptica é uma técnica analítica usada em muitos ramos da ciência. Ele usa luz para avaliar amostras para aprender informações importantes sobre sua estrutura e propriedades.
Para realizar espectroscopia óptica, uma fonte de luz é bruscada em uma amostra ou materials, e a maneira como a luz interage com a amostra é medida por um espectrômetro.
Embora muitas formas de luz possam ser usadas, é mais comum a luz da UVA e das regiões visíveis do espectro eletromagnético a serem usadas. Nesse caso, a técnica também é chamada de espectrometria UV-Vis, e a luz usada por comprimentos de onda de 190 a 750 nanômetros.
O espectrômetro óptico produzirá a intensidade da luz medida em função do comprimento de onda, e esses dados podem ser analisados de várias maneiras.
Existem diferentes tipos de espectroscopia óptica, nos quais diferentes aspectos da maneira como a luz interage com o materials é avaliada.
- Espectroscopia de transmissão: Mede quanta luz é capaz de passar por um materials em comprimentos de onda específicos para determinar sua opeidade.
- Espectroscopia de absorvância: Trabalha com o princípio da excitação e mede a atenuação da luz em diferentes comprimentos de onda.
- Espectroscopia de fotoluminescência: Mede quão fluorescente é um materials em diferentes comprimentos de onda detectando a luz emitida por um materials.
- Espectroscopia de refletividade difusa: Avalie a maneira como a luz se espalha uma amostra ou superfície.
A fonte de luz usada na espectroscopia óptica variará dependendo do tipo de medição que está sendo tomada. Normalmente, uma fonte monocromática que emite luz em um único comprimento de onda é usado para excitar materiais, por exemplo, para espectroscopia de fotoluminescência.
Por outro lado, uma fonte de banda larga que contém simultaneamente um espectro de luz em muitos comprimentos de onda diferentes é usada para medições de absorção, transmissão e reflexão.
Usos da espectroscopia óptica na indústria biológica
A espectroscopia óptica é frequentemente associada à ciência e engenharia de materiais, onde é usada como uma ferramenta barata que pode reunir muitas informações sobre a estrutura de um materials. No entanto, suas aplicações no campo biológico também são amplas e variadas, graças ao aspecto não destrutivo dessa técnica.
Análise farmacêutica
A espectroscopia UV-Vis é uma ferramenta importante na análise farmacêutica, pois fornece análises qualitativas de compostos orgânicos. Ao analisar uma pequena quantidade de um composto, muitas informações podem ser obtidas:
- Identificação química: A espectrometria de absorvância é particularmente útil para identificar a composição química de um composto. UM Espectrômetro UV-Vis pode ser usado para produzir um espectro de absorvância. Ao analisar a localização e a intensidade dos picos no espectro, a estrutura química do composto pode ser identificada. Isso pode ser usado para determinar o que é um composto desconhecido, mas também é útil para determinar se os compostos essenciais estão presentes em um produto fabricado.
- Pureza: Dentro dos produtos farmacêuticos, a pureza é uma prioridade. Um espectrômetro UV-vis pode ser usado para avaliar a pureza e a qualidade de um composto, verificando a quantidade de absorvância em comprimentos de onda de luz que se correlacionam com contaminantes conhecidos.
- Teste de dissolução: A espectrometria óptica pode ser usada para analisar a maneira como um composto se dissolve em uma solução. Isso fornece informações necessárias para determinar as doses de concentração oral dos compostos.
Dentro da indústria farmacêutica, a espectroscopia óptica também é usada para adesão regulatória. Os dados gerados por um espectrômetro podem ser usados para validar a qualidade e a composição de um composto para obter a aprovação da Meals and Drug Administration (FDA).
Extração de RNA
Uma das aplicações mais comuns da espectroscopia óptica é durante o processo de extração de RNA. A espectroscopia de absorvância pode ser usada para avaliar quanto RNA foi extraído e como é puro.
A pureza da amostra é particularmente importante, pois vários reagentes são usados no processo de extração que pode afetar a precisão dos estágios experimentais posteriores se não forem removidos corretamente.
Quando usado em um espectrômetro óptico, o RNA absorve a luz com um comprimento de onda de 260Nm. No entanto, os picos de absorvância dos compostos dentro do processo de extração são diferentes.
Por exemplo, as proteínas absorvem a luz a um comprimento de onda de 280 nm, enquanto o Trizol e o EDTA absorvem a 230 nm. Por esse motivo, as proporções entre os comprimentos de onda podem ser usadas para avaliar a pureza da amostra. Para o RNA, um valor de cerca de 2,0 é geralmente aceito como puro para as proporções 260: 280 e 230: 260.
A pureza do DNA pode ser analisada da mesma maneira, embora a proporção aceita de 260: 280 seja ligeiramente deslocada para 1,8 devido à presença da timina nucleotídica.
Cultura bacteriana
A espectroscopia óptica de transmissão pode ser usada para monitorar o crescimento celular e bacteriano. É uma técnica indireta que estima o número complete de células (vivas e mortas) by way of luz.
Quanto mais células houver dentro de uma solução, mais turva ou nublado aparecerá. Essa turbidez pode ser medida usando um espectrômetro óptico brilhando uma luz na amostra e medindo a quantidade de luz capaz de passar.
A turbidez é diretamente proporcional ao número de células; portanto, as medições podem ser usadas para quantificar a contagem de células e monitorar o crescimento ao longo do tempo.
Diagnóstico médico
Várias formas de espectroscopia óptica podem ser usadas para diagnosticar condições médicas, porque as interações leves podem fornecer informações sobre as propriedades de vários tecidos.
Em explicit, a espectroscopia óptica pode ser usada para detectar anormalidades teciduais para diagnosticar câncer. O tecido canceroso possui diferentes propriedades morfológicas e moleculares do tecido saudável, e essas diferenças podem ser identificadas usando espectroscopia óptica.
Além disso, a espectroscopia UV-Vis pode ser usada para quantificar biomarcadores preditivos para o diagnóstico e tratamento de cânceres. Por exemplo, pode ser usado para medir a saturação de oxigênio na hemoglobina e detectar outras alterações na composição do sangue com base na maneira como a luz é absorvida.
Mais recentemente, tem havido um interesse crescente no desenvolvimento de in vivo Usos da espectroscopia óptica. Aqui, a luz altamente localizada pode ser entregue a um paciente usando fibras ópticas para ajudar os médicos a fazer diagnósticos sem a necessidade de biópsias invasivas.
Esses sistemas podem ser integrados aos endoscópios existentes, o que significa que, no futuro, poderíamos ver essas ‘biópsias ópticas’ se tornando comum.
Vantagens e limitações da espectroscopia óptica
Pontos fortes
A espectroscopia óptica é uma técnica analítica versátil que possui muitas aplicações.
- Não destrutivo: A espectroscopia óptica não danifica ou destrói amostras, o que significa que elas podem ser reutilizadas em etapas adicionais de análise.
- Simples: Uma configuração de espectroscopia óptica é simples, consistindo em uma fonte de luz, a amostra sendo analisada e um detector (espectrômetro). É necessário pouco treinamento para realizar espectroscopia óptica, e a mesma configuração pode ser usada para analisar uma variedade de materiais e amostras.
- Barato: Comparado a outras ferramentas analíticas, a espectroscopia óptica é barata para comprar e operar, tornando -a acessível para muitos laboratórios.
- Compactar: Comparados a outros instrumentos analíticos que podem exigir uma bancada inteira ou mesmo seu próprio quarto, os espectrômetros ópticos geralmente são dispositivos compactos que podem ser armazenados em armários e trazidos conforme necessário. Isso é particularmente útil em um ambiente de laboratório, onde pode ser difícil encontrar espaço para novos equipamentos.
Limitações
Como em todas as técnicas analíticas, a espectroscopia óptica tem suas limitações e nem sempre é a técnica analítica mais adequada. Muitas vezes, as limitações e fontes de erro em torno da espectroscopia óptica vêm da preparação e configuração de equipamentos de amostra:
- Espalhamento de luz: Pode ser causado por partículas e bolhas sólidas que são suspensas em amostras líquidas. Isso faz com que a luz se espalhe, o que pode causar erros de medição e resultados irreproduzíveis.
- Alinhamento de amostra: A orientação e a posição da amostra dentro da configuração da espectrometria são muito importantes e devem ser consistentes para cada medição realizada. Se a cubeta que mantém a amostra estiver desalinhada com a fonte de luz ou o espectrômetro, poderá causar resultados imprecisos.
- Interferência: Às vezes, uma amostra pode conter vários compostos que possuem espectros sobrepostos. Se um composto for desconhecido, isso pode não ser óbvio ao analisar os espectros de absorvância. Sempre que possível, as espécies químicas devem ser separadas e examinadas individualmente para evitar essa interferência.
- Luz perdida: A espectroscopia óptica é a medição da luz, o que significa que qualquer luz perdida que atinge o espectrômetro pode contribuir para os dados que são emitidos. Essa luz pode vir de compartimentos ajustados incorretamente no instrumento ou no ambiente.
Espectroscopia óptica para aplicações biográficas resumidas
Como vimos, a espectroscopia óptica é uma técnica versátil que já está sendo usada em várias áreas diferentes da indústria biológica, da análise de medicamentos ao diagnóstico de câncer.
A pesquisa está sendo realizada continuamente para desenvolver novas aplicações de espectroscopia óptica e reduzir os erros que podem ocorrer em nossas configurações atuais.
