Explorando as águas desconhecidas da migração de células da ponta endotelial: uma história de aquaporinas, pressão hidrostática e angiogênese

Escrito por Li-Kun Phng

Atrás da história do papel de “Forças combinadas de pressão hidrostática e polimerização por actina acionam a migração de células endoteliais da ponta e a angiogênese do brotamento”.

Uma função crítica dos vasos sanguíneos é o transporte de plasma, células sanguíneas, nutrientes e metabólitos com eficiência no corpo. A formação e manutenção dos vasos sanguíneos como tubos ocos é, portanto, importante para sua função e é um interesse de pesquisa em nosso laboratório. Uma questão de longa knowledge nesse assunto é como as membranas apicais se expandem em manchas luminais, que se formam entre as células endoteliais, na fase inicial da formação de lúmen. Questionamos se isso poderia ocorrer através de forças físicas geradas de dentro do adesivo luminal que levaria a expansão das membranas apicais para formar um lúmen maior. Isso levou à hipótese de que as células endoteliais possam expulsar a água em sua superfície apical ao espaço luminal para aumentar a pressão hidrostática que, consequentemente, inflaria o lúmen. Enquanto estávamos explorando essa idéia, uma tela ScrNaseq em meu laboratório identificou dois canais de água endotelial, aqp1a.1 e aqp8a.1ser expresso diferencialmente nas redes vasculares do sangue do embrião de peixe -zebra em desenvolvimento. Enquanto aqp1a.1 O mRNA é expresso onipresentemente em todos os vasos sanguíneos, aqp8a.1 A expressão do mRNA é confinada aos vasos do tronco posterior e nas regiões ventrais dos vasos intersegmentares (ISVs). Portanto, especulamos que essas duas aquaporinas podem ter papéis distintos na formação e função dos vasos sanguíneos.

Igor, o primeiro autor do artigo, subsequentemente gerado por mutantes de peixe -zebra usando CRISPR/CAS9 para investigar a função de Aqp1a.1 e Aqp8a.1. Nossa análise inicial estava focada em determinar se os lúmens dos vasos sanguíneos se formaram normalmente em aqp1a.1 e aqp8a.1 mutantes. Para abordar isso, realizamos experimentos de microangiografia para examinar a perviedade do lúmen aos 2 e 3 dias após a fertilização (DPF), após os vasos do tronco terem lúmenos. Essa análise mostrou uma diminuição no número de ISVs que são totalmente perfundidos e um aumento no número de ISVs parcialmente perfundidos (Fig. 1), o que apoiou nossa hipótese de que o fluxo de água mediado por aquaporina pode ter um papel na formação de lúmen. No entanto, precisávamos excluir a possibilidade de que a diminuição dos ISVs totalmente perfundida possa ter surgido de um defeito em uma fase anterior da formação de ISV. Portanto, examinamos a angiogênese do surgimento em aqp1a.1 e aqp8a.1 mutantes. Isso levou muito tempo, pois precisávamos atravessar três linhas de peixe -zebra mutantes (aqp1a.1^-/-Assim, aqp8a.1^-/- e aqp1a.1^-/-;aqp8a.1^-/-) a uma linha repórter endotelial transgênica para visualizar a forma e comportamentos das células endoteliais. Eventualmente, durante a imagem ao vivo, descobrimos que as células da ponta endotelial sem aquaporinas endoteliais demoram mais tempo para emergir da aorta dorsal (ou não), gerar menos saliências de membrana e migrar mais lentamente, assim, a angiogênese de prejuízo prejudicada¹. Este foi um achado inesperado, uma vez que é uma percepção comum de que a migração celular endotelial depende predominantemente da remodelação do citoesqueleto de actina. Nossas descobertas implicam o fluxo de água mediado por aquaporina como um mecanismo alternativo de migração de células endoteliais in vivoe os defeitos na perfusão do lúmen observados são secundários à formação incompleta de ISV.

Como demonstramos que as aquaporinas mediam o fluxo de água em células de ponta endotelial in vivo?

Sabe -se que aquaporinas aumenta a permeação da água, permitindo que a água flua através da membrana plasmática em um gradiente osmótico². No entanto, não sabíamos em que direção flui a água como as células da ponta endotelial migram. Este foi (e ainda é) um desafio técnico, pois não existe um método disponível para rastrear o fluxo de água dentro das células em um organismo vivo. Tentamos, assim, abordar se a perda da função de aquaporina levaria a mudanças na viscosidade citoplasmática, rastreando (vídeo 1) e calculando o coeficiente de difusão (Fig. 2) de nanopartículas multiméricas codificadas geneticamente que se modificam em partículas esféricas com um diâmetro de 50nm (50nm-Gems)³. Infelizmente, não conseguimos observar uma diferença na mobilidade de 50nm-gem entre o tipo selvagem e aqp1a.1^-/-;aqp8a.1^-/- células de ponta endotelial. Ainda assim, isso não significava necessariamente que as aquaporinas não mediam o fluxo de água nas células endoteliais, pois o coeficiente de difusão de partículas depende do seu tamanho⁴. Em nosso experimento, os 50nm-GEMs podem não ser sensíveis o suficiente para detectar pequenas alterações na viscosidade citoplasmática que são alteradas pelo influxo de água ou efluxo, ou que as alterações na viscosidade podem ser confinadas às regiões locais da célula. Em seguida, recorremos à medição do quantity de células da ponta, com a suposição de que o quantity citoplasmático aumentaria se as aquaporinas medisassem o influxo de água ou diminuíssem se mediarem o efluxo de água. Usando essa abordagem, descobrimos que o quantity citoplasmático das células da ponta diminuiu quando Aqp1a.1 e Aqp8a.1 foram esgotados; Por outro lado, o quantity da célula de ponta aumentou quando o AQP1A.1 foi superexpressado. Juntamente com uma redução no alongamento da célula de ponta em aqp1a.1^-/-;aqp8a.1^-/- Os embriões, concluímos que as aquaporinas mediam o influxo de água nas células da ponta e, ao fazê -lo, aumentar a pressão hidrostática citoplasmática.

O que controla a direção do fluxo de água?

O fato de haver fluxo de água direcionado para as células da ponta aponta para a geração de um gradiente osmótico por células da ponta endotelial. Após uma das sugestões dos revisores, investigamos se o canal ânion, Swell1 (também conhecido como LRRC8a), pode gerar um gradiente osmótico na membrana celular para controlar o fluxo de água. Para nossa surpresa, a inibição química do swell1 fenocopiou muitos dos defeitos encontrados em aqp1a.1^-/-;aqp8a.1^-/- peixe -zebra, incluindo diminuição da protrusões da membrana, velocidade de migração e comprimento de ISV. Em suma, nosso trabalho sobre a função de aquaporina endotelial descobriu um novo papel da entrada de água acionada por pressão osmótica e aumento da pressão hidrostática na condução da migração de células da ponta endotelial e na angiogênese do brotamento in vivo ¹.

Essas novas descobertas me levaram de volta ao meu trabalho de pós-doutorado há mais de 10 anos, quando descobri que as células da ponta endotelial continuavam a migrar, embora mais lentamente, após a inibição da polimerização da actina e na ausência de filopodia⁵. (Esse achado foi outra surpresa, pois desafiou o dogma previamente mantido de que os filópodes são necessários para a migração de células polarizadas da ponta.) Curiosamente, as células da ponta foram capazes de gerar saliências da membrana do tipo lamelipodia sob a baixa dose de latrunculina B (lat. B) usada para inibir a formação de filopodia. Naquela época, eu assumi que a baixa dose de lat. B usado não inibiu todos os eventos de polimerização por actina, para que algumas protrusões de membrana baseadas em actina ainda pudessem ser geradas para conduzir a migração mais lenta observada. No entanto, nossos novos resultados sugeriram que os aumentos locais na pressão hidrostática no citoplasma poderiam ser a força motriz da migração residual observada. Para apoiar isso, inibimos a polimerização da actina e a pressão hidrostática, tratando aqp1a.1^-/-;aqp8a.1^-/- embriões com lat. B e descobriu que a migração das células da ponta e a formação de ISV foram mais severamente prejudicadas em comparação com sua inibição particular person. Este experimento last cimentou a conclusão de que as células da ponta endotelial empregam dois modos de migração – polimerização da actina e pressão hidrostática – para garantir uma angiogênese robusta de brotamento em tecidos fisicamente confinados.

Em suma, a jornada atrás do nosso artigo é uma das reviravoltas com uma revisita de uma observação passada. Essa ciência baseada em descoberta cheia de descobertas inesperadas é o que torna a pesquisa emocionante, e estou ansioso para descobrir mais surpresas nos comportamentos das células endoteliais!

Referências:

1. Kondrychyn, I., He, L., Wint, H., Betsholtz, C. & Phng, L.-Ok. Forças combinadas de pressão hidrostática e polimerização por actina acionam a migração das células da ponta endotelial e a angiogênese do brotamento. eLife 13RP98612 (2025).

2. Acordo, P. et al. Canais de água aquaporina – da estrutura atômica à medicina clínica. J. Physiol. 5423-16 (2002).

3. Hernandez, CM, Duran-Chaparro, DC, Eeuwen, T. Van, Rout, MP e Holt, LJ Desenvolvimento e caracterização de nanopartículas multiméricas codificadas geneticamente de 50 nanômetros. biorxiv 2024.07.05.602291 (2024) doi: 10.1101/2024.07.05.602291.

4. Sakai, Ok., Kondo, Y., Goto, Y. & Aoki, Ok. A fluidização citoplasmática contribui para quebrar a dormência de esporos no fermento de fissão. Proc. Natl. Acad. Sci. 121E2405553121 (2024).

5. Phng, LK, Stanchi, F. & Gerhardt, H. Filopodia são dispensáveis ​​para orientação da célula da ponta endotelial. Desenvolvimento 1404031-4040 (2013).

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