Se você estiver pesquisando em biotecnologia ou biologia sintética, não demorará muito até que você encontre o promotor PBAD ou Parabad em um de seus experimentos. Durante o meu mestrado, tornou -se rapidamente um merchandise básico, mostrando sua importância e prevalência em sistemas de expressão gênica controlados.
No entanto, também não demorou muito para entender suas limitações e a natureza fácil de mencionar.
Este artigo explica como expressar proteínas usando o promotor do PBAD e como evitar problemas comuns, como catabolismo de arabinose, repressão à glicose e expressão de vazamento.
Por que usamos promotores induzíveis?
A produção de proteínas recombinantes é uma prática comum na maioria das pesquisas de biociência. Os alvos proteicos comuns são insulina, anticorpos, proteínas fluorescentes ou qualquer outra proteína de interesse.
No entanto, essas experiências de expressão de proteínas não teriam sido possíveis sem promotores induzíveis. (1)
A maioria das proteínas heterologicamente expressas é tóxica para as bactérias hospedeiras, mesmo quando é um gene nativo que está sendo superexpressado.
Como a expressão está sobrecarregando a célula, poderia:
- Inibir o crescimento celular
- Causar morte celular
- Levar à perda do plasmídeo
Os promotores induzíveis ajudam a resolver esses problemas.
Eles nos permitiram controlar quando e em que taxa a proteína de juros está sendo expressa.
Ao contrário dos promotores constitutivos que são sempre ativos, os promotores induzíveis podem ser ligados e desligados sob condições específicas (concentração de ligante, pH, temperatura, luz, and so on.). (1)
Tais promotores tornaram a biologia muito mais authorized e mais fácil de projetar. Um exemplo é um biossensor para contaminantes da água (2) que pode detectar produtos químicos nocivos em tempo actual e iluminar com um brilho fluorescente, como uma pequena toxina de sinalização de firefly de alta tecnologia. Confira isso vídeo de como o biossensor funciona.
Como funciona o promotor do PBAD
O PBAD é um promotor induzível de resistência média. (3,10) A força do promotor reflete o nível de expressão de um promotor que é influenciado pela afinidade de ligação à RNA polimerase, interações do fator de transcrição e arquitetura de sequência. Você pode pensar no PBAD no meio do espectro do promotor entre o promotor T7 (forte) e o promotor HEXR/PZWF1 (fraco).
A expressão sob PBAD é regulada positiva e negativamente pela proteína ARAC. (4) Isso significa que ARAC está usando dois chapéus nesse processo. Ele pode reprimir ou ativar genes a jusante do PBAD.
Depende da presença ou ausência de L-arabinose (o indutor) no meio de cultura.
Seu mecanismo de ação é um pouco semelhante ao infame lac operon.
Quando a arabinose se liga ao ARAC, leva a uma mudança conformacional que abre o loop de DNA, permitindo que a RNA polimerase se liga e inicie a transcrição. (4,5)
Sem indução (sem arabinose adicionada), o ARAC se liga ao DNA como um repressor que proíbe o início da transcrição. A Figura 1 abaixo mostra uma visão geral esquemática do sistema de expressão do PBAD.
Figura 1. Um esquema simples do sistema de expressão do PBAD. (Crédito da imagem: Mariam Ezzelarab.)
O PBAD é um promotor bem controlado que é útil em muitos experimentos (10,11) como:
- Expressando genes altamente tóxicos
- Estudando mutações nulas de genes essenciais
- Otimizando a solubilidade de proteínas em E. coli
- Expressando proteínas da membrana
- Análise de função do gene
- Aplicações de biologia sintética
No entanto, pode ser complicado adotar se você nunca o usou antes, e há alguns problemas comuns a serem cientes. Aqui estão algumas maneiras pelas quais o PBAD pode estragar seus experimentos e como evitá -los.
Problemas comuns com o pbad e como evitá -los
Expressão com vazamento
O vazamento de expressão ocorre quando um promotor induzível aciona a expressão do gene, mesmo quando o indutor está ausente.
O vazamento pode não representar um grande problema em alguns experimentos, mas em outros, pode ser uma mudança de jogo, de qualquer maneira, vale a pena considerar seu impacto.
Uma das minhas primeiras vezes trabalhando com Pbad, eu estava construindo um interruptor de alternância em E. coli.
Eu esperava a expressão da proteína fluorescente vermelha em caso de indução (L-arabinose adicionada ao meio) e proteína fluorescente verde, se o indutor não foi adicionado.
No entanto, os resultados não foram o que eu previa.
A expressão de vazamento do promotor do PBAD foi evidente em minhas amostras, com a proteína fluorescente vermelha aparecendo mesmo quando a arabinose não foi adicionada ao meio, como você pode ver na Figura 2 abaixo. Fiquei atordoado. Meus professores e supervisores? Não tanto.
Figura 2. Comparação quantitativa da indução de proteína fluorescente com e sem L-arabinose. Há fluorescência correspondente à expressão da proteína fluorescente vermelha (a linha vermelha), apesar de nenhuma arabinose estar presente. (Crédito da imagem: Mariam Ezzelarab.)
Eles sabiam a verdade: a biologia não é binária. O ambiente celular é caótico, e este é um exemplo claro dessa estocástica. Eles já haviam visto tudo isso antes, especialmente com o promotor do PBAD.
Catabolismo de Arabinose
L-arabinose é um açúcar. Não é exatamente um prato connoisseur bacteriano (como a glicose), mas eles ainda se dedicam quando estiver no menu!
Isso resulta em um problema
E. coli pode consumir o indutor (3,5,6), causando expressão inconsistente devido ao esgotamento da arabinose no meio ao longo do tempo.
Para evitar esse problema, sempre evite usar o tipo selvagem E. coli com pbad. Em vez disso, opte por cepas de hospedeiro mutadas para serem deficientes no catabolismo de L-arabinose, como TOP10 ou LMG194. (3)
Repressão à glicose
Ao trabalhar com os sistemas PBAD, a glicose é um amigo e um inimigo. (7)
Como mencionado acima, as bactérias favorecem a glicose muito mais do que qualquer outra fonte de carbono.
Podemos fazer bom uso desse recurso adicionando glicose na mídia para reprimir ainda mais a expressão gênica na ausência do indutor (3,10) e atuar como uma barreira adicional que impede a expressão gênica durante o estado off.
No entanto, a glicose pode ser um problema no estado, simplesmente porque as bactérias optarão por captar a glicose da mídia em vez de L-arabinose.
Portanto, o indutor não entrará na célula e não induzirá a expressão do gene. A Figura 1 no Registro IGEM para Pbad ilustra este poço.
Este problema é fácil de resolver.
Tudo o que você precisa é ser cauteloso ao selecionar um meio bacteriano para o seu experimento. Não considere apenas a mídia superb da tensão para o crescimento, mas também verifique a composição da mídia superb para a indução superb do promotor.
Em um dos meus experimentos, expressei beta-caroteno sob o controle do promotor do PBAD.
Enquanto a temperatura, o tempo de indução e a concentração do indutor foram exatamente as mesmas, diferentes composições de mídia foram testadas. Confira a Figura 3 abaixo para ver como a proteína de concentração de juros variou de um meio para outro devido a diferentes composições.
Figura 3. Análise comparativa da produção de beta-caroteno em diferentes meios bacterianos. (Crédito da imagem: Mariam Ezzelarab.)
Para o meu experimento, o caldo LB (Luria/Miller), o caldo LB (Lennox) e o caldo fantástico resultou no rendimento máximo, pois não continham glicose para inibir a indução de PBAD.
Tudo ou nada
Pbad dá origem a um fenômeno conhecido como “All-ou None”.
Isso significa que nas concentrações subsaturadas do indutor (onde a célula não atingiu a saturação complete e ainda tem espaço para mais), em vez de obter um nível uniforme e incremental de indução, você acaba com uma mistura.
Algumas das células são totalmente induzidas, enquanto outras não são induzidas. Como você pode ver na Figura 4, quando a expressão da proteína é medida no nível da população, ela dá a aparência de um gradiente suave de expressão. No entanto, isso não significa que as células individuais estão expressando mais proteína, mas mais células começam a ser induzidas.
Isso pode ser crítico em alguns experimentos devido à produção inconsistente de proteínas, tornando difícil estudar as relações dose-resposta e pode levar à má interpretação dos resultados.
Não há mitigação direta para esse fenômeno. No entanto, aqui estão algumas dicas que podem ajudá -lo a projetar um sistema mais eficiente e preciso.
Um punhado de Igem As equipes de competição concluíram que o promotor do PBAD exibe um comportamento quase ou nada após a indução com arabinose quando localizado em um vetor de cópia alta, mas permite a indução gradual quando clonado em um vetor de cópia baixa. (8,9)
Outro método envolve aumentar a expressão do transportador arabinose. (12) Isso deve reduzir a concentração limiar necessária para a indução e garantir a captação uniforme em toda a população e, assim, reduzir a heterogeneidade da população celular.
Figura 4. Indução de genes de tudo ou nada do PBAD. Um desenho simples mostrando comportamento tudo ou nada. No nível das células únicas, aumentar o indutor altera a razão entre as células ON e OFF. (Adaptado de Carla J. Davidson et al. (2008); Crédito da imagem: Mariam Ezzelarab.)
Usando o PBAD em resumo
O PBAD poderia expressar alguns alvos de maneira fantástica e alguns terrivelmente, provando eficiente em alguns estudos e desastrosos em outros. Provavelmente isso é verdade para todos os promotores; Você nunca saberá até experimentar.
Um promotor induzível perfeito usaria um indutor barato, seria inofensivo ao metabolismo do host, não requer transportadores especiais e possui uma alta faixa dinâmica, baixa vazamento, cinética rápida, alta especificidade e níveis de expressão ajustável. Melhor ainda, funcionaria em muitas espécies e aumentaria facilmente para uso industrial.
Obviamente, um sistema que esse perfeito provavelmente não existe!
Mas se você está se perguntando qual promotor deve tentar a seguir para sua expressão de proteínas, agora tem uma idéia difícil de o PBAD funcionar e como solucionar alguns problemas que podem ocorrer ao otimizar sua expressão de proteína
Referências
- Gearing M. Plasmídeos 101: promotores induzíveis. Addgene. Publicado em 18 de janeiro de 2018. (Acessado em 4 de fevereiro de 2025)
- Jung Jk et al. (2020). Biossensores sem células para detecção rápida de contaminantes de água. Biotecnologia da natureza. 38: 1451-1459
- vetor de proteína recombinante bacteriana Pbad. Construtor de vetores. (Acessado em 4 de fevereiro de 2025)
- Schleif R. (2003). Proteína ARAC: um relacionamento amor. BIOESSAYS 25: 274-282
- Schleif R. (2021). O trabalho de uma carreira, o l-arabinose operon: como funciona e como aprendemos. Ecosal Plus 10
- Miyada cg et al. (1984). Regulação do gene ARAC de Escherichia coli: repressão, autoregulação e efeito de catabolito na expressão de Arabad. Pnas 81: 4120-4124
- Simcikova m et al. (2014). Sobre o efeito duplo da glicose durante a produção de minicírculos à base de PBAD/ARAC. Vacina. 24: 2843-2846
- Cu Boulder Igem Crew 2015. Resposta de teste do promotor do PBAD com Arabinose. Igem. (Acessado em 4 de fevereiro de 2025)
- Equipes IGEM. Promotor induzível do PBAD/ARAC. Registro de partes biológicas padrão. (Acessado em 4 de fevereiro de 2025)
- Guzman LM et al. (1995). Regulação rígida, modulação e expressão de alto nível por vetores que contêm o promotor de arabinose pbad. Jornal de Bacteriologia 177: 4121-4130
- Brautaset t et al. (2008). Sistemas de expressão bacteriana regulada positivamente. Biotecnologia microbiana 2: 15–30
- Széliová d et al. (2016). Modulação da expressão heteróloga do promotor de PBAD em Cherichia coli de produção de produção. Jornal de Biotecnologia 236: 1–9
- Davidson CJ et al. (2008). Individualidade em bactérias. Revisão anual da genética 42: 253–268
