Novos métodos iluminam as membranas lipídicas e permitem o mapeamento de proteínas de alta resolução

Em biologia, ver pode levar ao entendimento, e os pesquisadores do laboratório do professor Edward Boyden no Instituto McGovern for Mind Analysis estão comprometidos em trazer a vida em foco mais nítido. Com um par de novos métodos, eles estão expandindo as capacidades da microscopia de expansão-uma técnica de imagem de alta resolução que o grupo introduziu em 2015-para que os pesquisadores em todos os lugares possam ver mais quando olham para células e tecidos sob um microscópio leve.

“Queremos ver tudo, então estamos sempre tentando melhorá -lo”, diz Boyden, professor de neurotecnologia de Y. Eva Tan no MIT. “Um instantâneo de toda a vida, até seus blocos fundamentais de construção, é realmente o objetivo”. Boyden também é um investigador do Instituto Médico Howard Hughes e membro do Yang Tan Collective no MIT.

Com novas maneiras de manchar suas amostras e processamento de imagens, usuários de microscopia de expansão Agora pode ver contornos vívidos das formas das células em suas imagens e identificar a localização de muitas proteínas diferentes dentro de uma única amostra de tecido com resolução que excede em muito a da microscopia de luz convencional. Esses avanços, ambos relatados em forma de acesso aberto no diário Comunicações da naturezaAtive novas maneiras de rastrear as projeções delgadas dos neurônios e visualizar relações espaciais entre moléculas que contribuem para a saúde e a doença.

A microscopia de expansão usa um hidrogel absorvente de água para expandir fisicamente os tecidos biológicos. Depois que uma amostra de tecido foi permeada pelo hidrogel, ela é hidratada. O hidrogel incha à medida que absorve a água, preservando as localizações relativas das moléculas no tecido, pois as afasta suavemente uma da outra.

Como resultado, os componentes celulares lotados parecem separados e distintos quando o tecido expandido é visto sob um microscópio leve. A abordagem, que pode ser realizada usando equipamentos de laboratório padrão, tornou a imagem de super-resolução acessível à maioria das equipes de pesquisa.

Desde o primeiro desenvolvimento da microscopia de expansão, Boyden e sua equipe continuaram aprimorando o método – aumentando sua resolução, simplificando o procedimento, planejando novos recursos e integrando -o com outras ferramentas.

Visualizando membranas celulares

Um dos mais recentes avanços da equipe é um método chamado microscopia de expansão de membrana ultraestrutural (UMEXM), que eles descrito na edição de 12 de fevereiro de Comunicações da natureza.

Com ele, os biólogos podem usar microscopia de expansão para visualizar as membranas finas que formam os limites das células e envolvem as organelas dentro delas. Essas membranas, construídas principalmente de moléculas chamadas lipídios, têm sido notoriamente difíceis de rotular densamente em tecidos intactos para imagem com microscopia leve. Agora, os pesquisadores podem usar o UMEXM para estudar ultraestrutura e organização celular nos tecidos.

Tay Shin Sm ’20, Ph.D. ’23, um ex-estudante de pós-graduação em Boyden’s Lab e J. Douglas Tan, no Centro de Pesquisa de Autismo Tan-Yang, no MIT, liderou o desenvolvimento da UMEXM. “Nosso objetivo period muito simples no início: vamos rotular as membranas em tecido intacto, como um microscópio eletrônico usa tetróxido de ósmio para rotular as membranas para visualizar as membranas no tecido”, diz ele. “Acontece que é extremamente difícil conseguir isso”.

A equipe primeiro precisava projetar um rótulo que tornaria as membranas em amostras de tecido visíveis sob um microscópio leve. “Quase tivemos que começar do zero”, diz Shin. “Nós realmente tivemos que pensar nas características fundamentais da sonda que rotulará a membrana plasmática e depois pensar em como incorporá -las à microscopia de expansão”. Isso significava engenharia uma molécula que se associaria aos lipídios que compõem a membrana e a vinculariam ao hidrogel usado para expandir a amostra de tecido e uma molécula fluorescente para visibilidade.

Depois de otimizar o protocolo de microscopia de expansão para visualização da membrana e testar extensivamente e melhorar as sondas em potencial, Shin encontrou sucesso uma noite no laboratório. Ele colocou uma amostra de tecido expandida em um microscópio e viu esboços nítidos das células.

Devido à alta resolução permitida pela expansão, o método permitiu que a equipe de Boyden identificasse até os pequenos dendritos que se projetam dos neurônios e verem claramente as longas extensões de seus axônios delgados. Esse tipo de clareza pode ajudar os pesquisadores a seguir os caminhos de neurônios individuais nas redes densamente interconectadas do cérebro, dizem os pesquisadores.

Boyden liga para traçar esses processos neurais “uma das principais prioridades do nosso tempo na ciência do cérebro”. Tradicionalmente, esse rastreamento se baseia muito na microscopia eletrônica, que requer habilidades especializadas e equipamentos caros. Shin diz que porque a microscopia de expansão usa um padrão microscópio leveé muito mais acessível aos laboratórios em todo o mundo.

Shin e Boyden apontam que os usuários da microscopia de expansão podem aprender ainda mais sobre suas amostras quando combinam a nova capacidade de revelar membranas lipídicas com rótulos fluorescentes que mostram onde as proteínas específicas estão localizadas. “Isso é importante, porque as proteínas fazem muito do trabalho da célula, mas você quer saber onde estão em relação à estrutura da célula”, diz Boyden.

Uma amostra, muitas proteínas

Para esse fim, os pesquisadores não precisam mais escolher apenas algumas proteínas para ver quando usam microscopia de expansão. Com um novo método chamado expansão multiplexada de revelação (multiexr), os usuários agora podem rotular e ver mais de 20 proteínas diferentes em uma única amostra. Os biólogos podem usar o método para visualizar conjuntos de proteínas, ver como são organizados em relação um ao outro e gerar novas hipóteses sobre como eles podem interagir.

Uma chave para esse novo método, relatado 9 de novembro de 2024, em Comunicações da naturezaé a capacidade de vincular repetidamente anticorpos rotulados fluorescentemente a proteínas específicas em uma amostra de tecido expandida, imaginá -las e retirar -as e usar um novo conjunto de anticorpos para revelar um novo conjunto de proteínas. O pós-doutorado Jinyoung Kang ajustou cada etapa desse processo, garantindo que as amostras de tecido permaneçam intactas e as proteínas marcadas produziram sinais brilhantes em cada rodada de imagem.

Depois de capturar muitas imagens de uma única amostra, a equipe de Boyden enfrentou outro desafio: como garantir que essas imagens estivessem em perfeito alinhamento para que pudessem ser sobrepostas entre si, produzindo uma imagem last que mostrava as posições precisas de todas as proteínas que foram rotuladas e visualizadas uma por uma.

A microscopia de expansão permite que os biólogos visualizem algumas das minúsculas características das células – mas encontrar os mesmos recursos repetidamente durante várias rodadas de imagem, a equipe de Boyden precisava primeiro para casa em uma estrutura maior. “Esses campos de vista são realmente pequenos, e você está tentando encontrar esse pequeno campo de visão em um gel que realmente se tornou bastante grande depois de expandi -lo”, explica Margaret Schroeder, uma estudante de pós -graduação no laboratório de Boyden que, com Kang, liderou o desenvolvimento da Multiexr.

Para navegar para o native certo toda vez, a equipe decidiu rotular os vasos sanguíneos que passam por cada amostra de tecido e usá -los como guia. Para ativar o alinhamento preciso, certos detalhes finos também necessários para aparecer consistentemente em todas as imagens; Para isso, a equipe rotulou várias proteínas estruturais. Com esses pontos de referência e software program de processamento de imagem personalizado, a equipe conseguiu integrar todas as suas imagens de uma amostra em uma, revelando como as proteínas que haviam sido visualizadas separadamente foram organizadas em relação uma à outra.

A equipe usou multiexr para olhar as placas amilóides – o aberrante proteína Clusters que se desenvolvem notoriamente nos cérebros afetados pela doença de Alzheimer. “Nós poderíamos olhar dentro daqueles Placas amilóides E pergunte, o que há dentro deles? E como podemos manchar para muitas proteínas diferentes, poderíamos fazer uma exploração de alto rendimento “, diz Boyden. A equipe escolheu 23 proteínas diferentes para ver em suas imagens. A abordagem revelou algumas surpresas, como a presença de certos receptores de neurotransmissores (AMPARs).

“Aqui está um dos receptores mais famosos de toda a neurociência, e aí está, escondendo -se em uma das características moleculares mais famosas da patologia na neurociência”, diz Boyden. Não está claro qual o papel, se houver, os receptores desempenham na doença de Alzheimer – mas a descoberta ilustra como a capacidade de ver mais células internas pode expor aspectos inesperados da biologia e levantar novas questões para a pesquisa.

Esta história é republicada, cortesia do MIT Information (net.mit.edu/newsoffice/), um web site widespread que abrange notícias sobre pesquisa, inovação e ensino do MIT.