Duas cabeças são melhores que uma, como diz o ditado, e às vezes dois instrumentos, recombinados engenhosamente, podem realizar feitos que nenhum deles poderia ter feito por conta própria.
É o caso de um microscópio híbrido, nascido no Laboratório Biológico Marinho (MBL), que, pela primeira vez, permite que os cientistas imaginem simultaneamente a orientação 3D completa e a posição de um conjunto de moléculas, como proteínas marcadas dentro das células. A pesquisa é publicada esta semana em Anais da Academia Nacional de Ciências.
O microscópio combina a tecnologia de fluorescência polarizada, uma ferramenta valiosa para medir a orientação das moléculas, com um microscópio de folha de luz de visão dupla (DISPIM), que se destaca na imagem ao longo do eixo de profundidade (axial) de uma amostra.
Esse escopo pode ter aplicativos poderosos. Por exemplo, as proteínas alteram sua orientação 3D, normalmente em resposta ao seu ambiente, o que lhes permite interagir com outras moléculas para desempenhar suas funções.
“Usando este instrumento, as mudanças de orientação da proteína 3D podem ser registradas”, disse o primeiro autor Talon Chandler, da CZ Biohub San Francisco, um ex -aluno da Universidade de Chicago que conduziu esta pesquisa em parte da MBL. “Existe uma biologia actual que pode estar oculta para você apenas de uma mudança de posição de uma molécula”, disse ele.
Imagem das moléculas no eixo de uma célula divisória – um desafio de longa knowledge na MBL e em outros lugares – é outro exemplo.
“Com a microscopia tradicional, incluindo a luz polarizada, você pode estudar bem o eixo se estiver no plano perpendicular à direção de visualização. Assim que o avião for inclinado, a leitura se torna ambígua”, disse o co-autor Rudolf Oldenbourg, um sênior Cientista da MBL. Este novo instrumento permite que se “corrija” para inclinar e ainda capturar a orientação 3D e a posição das moléculas do fuso (microtúbulos).
A equipe espera tornar seu sistema mais rápido para que eles possam observar como a posição e a orientação das estruturas nas amostras vivas mudam com o tempo. Eles também esperam que o desenvolvimento de futuras sondas fluorescentes permitirá que os pesquisadores usem seu sistema para imaginar uma maior variedade de estruturas biológicas.
Uma confluência de visão
O conceito para esse microscópio gerou em 2016 através do brainstorming por inovadores em microscopia que se reuniu na MBL.
Hari Shroff, de Hhmi Janelia, então no Nationwide Institutes of Well being (NIH) e um membro da MBL Whitman, estava trabalhando com seu microscópio de descarga personalizado na MBL, que ele construiu em colaboração com Abhishek Kumar, agora na MBL.
O microscópio de descarga possui dois caminhos de imagem que se encontram em um ângulo reto na amostra, permitindo que os pesquisadores iluminem e imaginem a amostra de ambas as perspectivas. Essa visão dupla pode compensar a baixa resolução de profundidade de qualquer visão única e iluminar com mais controle sobre a polarização do que outros microscópios.
Na conversa, Shroff e Oldenbourg perceberam que o microscópio de visão dupla também poderia abordar uma limitação da microscopia de luz polarizada, que é difícil iluminar com eficiência a amostra com luz polarizada ao longo da direção da propagação da luz.
“Se tivéssemos duas vistas ortogonais, poderíamos sentir a fluorescência polarizada nessa direção muito melhor”, disse Shroff. “Pensamos, por que não usar o disposto para fazer algumas medições de fluorescência polarizada?”
Shroff estava colaborando na MBL com Patrick La Rivière, professor da Universidade de Chicago, cujo laboratório desenvolve algoritmos para sistemas de imagem computacional. E La Rivière teve um novo estudante de pós -graduação em seu laboratório, Talon Chandler, que ele trouxe para a MBL. O desafio de combinar esses dois sistemas se tornou a tese de doutorado de Chandler e ele passou o ano seguinte no laboratório de Oldenbourg na MBL trabalhando nela.
A equipe, que no início, incluía Shalin Mehta, depois baseada na MBL, equipou a disposição com cristais líquidos, o que lhes permitiu alterar a direção da polarização de entrada.
“E então passei muito tempo trabalhando, como seria uma reconstrução para isso? Qual é o máximo que podemos recuperar desses dados que agora estamos começando a adquirir?” Chandler disse. O co-autor Min Guo, então localizado no laboratório anterior de Shroff no NIH, também trabalhou incansavelmente nesse aspecto, até que eles atingiram seu objetivo de reconstruções 3D completas da orientação e posição moleculares.
“Havia toneladas de conversa cruzada entre a MBL, a Universidade de Chicago e o NIH, enquanto trabalhamos isso”, disse Chandler.
