Procurando um protocolo de transdução lentiviral fácil de seguir? Este artigo leva você do projeto experimental à produção lentiviral e confirmação de transdução bem-sucedida, com dicas práticas úteis para ajudar a tornar seu experimento um triunfo.
Como funcionam os sistemas de entrega lentiviral
O uso de sistemas de entrega viral A transdução de células para investigações de genes e proteínas tornou -se proeminente nos últimos 20 anos.
Um benefício é que os vetores lentivirais permitem a expressão estável do seu gene de interesse. Os lentivírus (um gênero de retrovírus) expressam transcriptase reversa, que converte o RNA viral em DNA de fita dupla, e a integrase, que insere esse DNA viral no DNA do hospedeiro.
Uma vez que o DNA viral é integrado ao DNA do host, ele se divide junto com a célula hospedeira e nenhum é o mais sábio. A principal diferença entre retrovírus e lentivírus é que o retrovírus infecta apenas as células divisórias, enquanto o lentivírus infecta células divisórias e não divididas, (1), possibilitando a infecção de células pós-mitóticas como neurônios. (2)
Considerações ao planejar transdução lentiviral
Como todos nos lembramos da classe de microbiologia, os vírus precisam de células para “sobreviver”, pois não possuem a maquinaria de replicação para produzir mais cópias de seu genoma. Portanto, um dos aspectos mais importantes dos experimentos do sistema de entrega de vetores lentivirais é a produção actual de vetores lentivirais, que geralmente ocorre nas células HEK293 (ou alguma variedade).
Por exemplo, um uso comum de sistemas de entrega de lentivírus é inserir RNAs curtos de gancho de cabelo (shRNA) para knockdown de genes mediados por RNAi. Nesse caso, o shRNA é primeiro embalado no vetor lentiviral e é usado para transfectar células HEK293. Essas células transfectadas podem incubar por ~ 3 dias, o que permite que o lentivírus replique e produza partículas lentivirais que são então colhidas, titeradas e usadas para transduzir células alvo.
Antes de iniciar qualquer experimento, é sempre uma boa idéia planejar com antecedência e solicitar todos os componentes necessários. Para experimentos de transfecção e transdução, você precisará:
reagentes para maxiprep/midiprep;
Mídia para cultivar células HEK293 e suas células de interesse;
reagentes de transfecção como lipofectamina; e
o antibiótico apropriado (se estiver usando um gene resistente a antibióticos para selecionar células transduzidas).
Método de seleção
Nem todas as células serão transduzidas com sucesso e, portanto, você precisará de uma maneira de distinguir ou selecionar células que foram transduzidas. Existem duas maneiras principais de conseguir isso:
Expressão de um gene de resistência a antibióticos. As células transduzidas expressarão o gene de resistência, o que significa que elas podem sobreviver na presença do antibiótico, enquanto as células não transduzidas morrerão. Este método é uma maneira relativamente simples de selecionar suas células de interesse.
Expressão de um marcador fluorescente. Por exemplo, seu plasmídeo de interesse também pode conter uma proteína fluorescente, como a GFP, oferecendo uma maneira de distinguir células que foram transduzidas. Se seus experimentos a jusante envolverem microscopia ou citometria de fluxo, isso pode ser uma alternativa viável ao uso de antibióticos.
Controles para o seu protocolo de transdução lentiviral
Ter os controles apropriados é essencial para garantir que você possa confiar nos seus resultados e é basic para a solução de problemas quando as coisas dão errado. Existem três controles necessários para qualquer protocolo de transdução lentiviral:
Controles positivos
Isso permite que você verifique se o processo de transdução é bem -sucedido, para que, se o seu experimento não funcionar (por exemplo, você não obtém um knockdown ou veja a expressão exógena de proteínas), você sabe que a etapa de transdução não foi o problema.
Uma boa opção de controle positivo é a transdução de um marcador fluorescente. Isso significa que você pode ver facilmente em um microscópio se a etapa de transdução foi um sucesso.
Controles negativos
As células infectadas com lentivírus em branco (como em tudo, menos o seu DNA de interesse) podem dizer se a etapa de transdução lentiviral teve um efeito negativo nas células ou ajuda a confirmar que qualquer fenótipo que você vê é um efeito direto da knockdown ou superexpressão e não porque porque porque de efeitos não específicos do processo de transdução ou infecção viral.
Outro controle negativo importante para determinar onde surgiram mudanças fenotípicas são células não transduzidas. Se suas células experimentais e células lentivirais em branco estiverem mostrando alterações fenotípicas (por exemplo, estressadas ou moribundas), mas suas células não transmitidas são boas, é provável que a transdução esteja causando problemas.
Protocolo de transdução lentiviral passo a passo
Existem 2 etapas principais para a transdução lentiviral:
Gerando seu vírus embalado; e
Transdução de suas células -alvo.
Para obter bons títulos virais, você precisa primeiro garantir que as células que você usarão para produção viral sejam felizes e saudáveis. As células HEK293 são fáceis de transfectar e, portanto, fazem uma excelente opção para produzir seu lentivírus embalado.
Mantenha suas células Hek293 felizes
As células devem ser rotineiramente verificadas e divididas quando atingirem cerca de 80% de confluência.
As células HEK293 estão crescendo rapidamente e tripsinizam rapidamente; portanto, não permita que elas incubem por muito tempo em tripsina (30-60 segundos devem fazê-lo), ou você pode testemunhar a morte celular grande.
As células descongeladas do estoque congelado devem ser passadas pelo menos duas vezes antes de semear para o experimento de transdução.
Outro ponto importante a lembrar é lidar com pratos contendo células com muita delicadeza, pois as células se destacam facilmente.
Para o experimento de transfecção, as células HEK293 devem ser semeadas em cerca de 5 x 106 Células/10 cm de prato ou de forma que as células sejam cerca de 40 a 50% de confluência na manhã seguinte (dia da transfecção).
Embalar o vírus
Quando suas células estiverem prontas para transfectar, o próximo passo é empacotar o plasmídeo vetorial lentiviral, juntamente com embalagens virais e vetores de envelope, em lipossomas para entrega nas células HEK293.
Lipofectamina, ou reagente de transfecção semelhante.
Plasmídeo contendo DNA de interesse (por exemplo, gene para expressar ou shRNA)
Plasmídeos de embalagem (3ª geração usam dois: um codificação mordaça e Polo outro codificando Rev.
Plasmídeo envelope.
Células HEK293 a ~ 40-50% de confluência.
Mídia completa fresca.
Protocolo para produção lentiviral
Adicione 500 µl de mídia Optimem a dois tubos de 1,5 ml rotulados Tubo a e Tubo b.
Tubo a: Adicione 60 µl de lipofectamina.
Tubo b: Adicione uma proporção igual do plasmídeo com shRNA, plasmídeo do envelope e plasmídeo de embalagem no tubo. Por exemplo: 10 µg do shRNA, 5 µg do plasmídeo codificando GAG e POL, 5UG do plasmídeo que codifica rEV e 10 µg do plasmídeo do envelope.
Toque suavemente nos tubos para misturar, flash girando e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
Adicione o conteúdo do tubo B ao tubo A Dropwise, monte o tubo suavemente para misturar, girar o flash e incubar em temperatura ambiente por 45 minutos.
Nesta fase, substitua a mídia nas células HEK293 com 5 ml de mídia Optimem.
Agora que temos a mistura de transfecção com o shRNA, plasmídeos de embalagem e lipofectamina, é hora de começar a embalar.
Inclua a placa de Petri com células HEK293 e adicione a mistura de transfecção gota a gota ao meio coletado. Neste ponto, se você não for gentil, poderá ver as células HEK293 ficando infelizes e desalojando. Portanto, seja cauteloso ao adicionar a mistura de transfecção.
Agite cuidadosamente a placa para misturar o meio e distribuir uniformemente a mistura de transfecção nas células.
Incubar as células por 5-8 horas no meio livre de soro.
Aspiram delicadamente o meio (isso conterá quaisquer lipossomas contendo plasmídeo que não transfectassem as células HEK293) e adicionem 10 ml de meio completo ao lado da placa para que as células não se destacem.
As células HEK293 empacotarão o shRNA em uma partícula viral e a liberarão no meio. A partir deste ponto, a mídia será rica em partículas de vírus; portanto, o EPI adequado deve ser usado durante o manuseio.
Colete a mídia (partículas de vírus) após 48 horas e adicione 10 ml de mídia completa fresca à mesma placa.
Colete a mídia novamente após 72 horas e mix -a com a mídia coletada em 48 horas.
Filtrar esterilizar o meio coletado combinado, passando por um filtro de 0,45 μm para permitir o fluxo do vírus.
Os ciclos de congelamento e inchaço reduzirão a potência do vírus, por isso é uma boa idéia fazer alíquotas de 2,5 ml do vírus.
O vírus pode ser armazenado a 4 ° C por cerca de um mês ou dois e a -20 ° C a longo prazo. Sempre use alvejante para descartar as pontas e pratos de pipeta usados durante a produção de vírus.
Colocando o vírus nas células: protocolo para transdução lentiviral
Agora que temos o vírus, é hora de infectar as células alvo. Na maioria dos casos, é importante tocar seu vírus para que você saiba a concentração usada para o seu experimento e possa repetir seus resultados com segurança!
No entanto, nesse método específico, pretendemos apenas obter um bom knockdown. Isso é conseguido transduzindo pelo menos 50% das células com o vírus. Use uma proporção igual de vírus e células para obter 50% de transdução.
Reagentes para transdução lentiviral
Células de interesse para transduzir.
Vírus.
Polibeno.
Mídia completa fresca.
Protocolo para transdução lentiviral
Em um tubo de 15 ml, ressuspense cerca de 2 milhões de células (~ 1/4 de um prato confluente de 10 cm) em 2,5 ml de mídia completa.
No mesmo tubo, adicione 2,5 ml de vírus (~ 1/4 do vírus complete obtido de um prato de 10 cm) e 15 μg/ml de polibreno. O polibeno aumenta a eficiência da transdução, neutralizando as cargas entre partículas virais e a membrana celular. (3) No entanto, o mecanismo exato não é bem compreendido.
Misture suavemente e coloque as células em um novo prato de 10 cm.
Após 24 horas, substitua a mídia por meio completo sem vírus.
Se a construção shRNA continha um marcador fluorescente, você poderá verificar o sucesso da integração 48 horas após a transfecção; Caso contrário, vá em frente com a seleção de antibióticos por mais 48 horas. Normalmente, inicio a transdução em uma quarta -feira, para que as células possam ser selecionadas no fim de semana.
Confirmando a transdução viral bem -sucedida
Knockdown ou expressão bem -sucedida de uma proteína exógena precisa ser confirmada. Uma maneira simples de fazer isso é o Western blotting. Para knockdowns, você deve ver uma perda ou redução na sua proteína de interesse.
Para a expressão exógena de proteínas, você poderá detectar sua proteína de interesse com um anticorpo específico para essa proteína ou elevado contra uma etiqueta (por exemplo, GFP) para proteínas marcadas.
Se você usou um marcador fluorescente ou está expressando uma proteína marcada com fluorescência, pode verificar sob um microscópio ou por citometria de fluxo para o sinal fluorescente.
Suporte adicional para o seu protocolo de transdução lentiviral
Ouvi muitas informações conflitantes sobre o que você deve ou não fazer para obter uma boa produção viral? Separe o fato da ficção lendo nosso guia Produção de vetores virais: mitos e equívocos.
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Publicado originalmente em 13 de setembro de 2018. Revisado e atualizado em abril de 2022.
Referências:
Adicione o gene. Guia lentiviral. Acesso em 21 de abril de 2022.
