O rastreamento metabólico é uma das ferramentas mais poderosas para estudar a atividade das vias metabólicas. Como biólogo, entrar no mundo das técnicas de química analítica pode ser intimidante.
É por isso que estamos fornecendo um guia para iniciantes que ajudará a tornar o rastreamento metabólico compreensível, acessível e aplicável às questões de pesquisa cotidianas.
O que é rastreamento metabólico e por que devo me importar?
As vias metabólicas incluem todos as reações químicas em um organismo que sustentam a função biológica, desde a replicação do DNA até modificações pós-traducionais.
Especificamente, as vias metabólicas consistem em reações químicas interligadas que convertem uma determinada molécula em uma série de intermediários antes de produzir um produto que será eventualmente excretado.
Na investigação biológica, as técnicas que nos permitem seguir o destino das moléculas através destas reações podem fornecer informações biológicas poderosas, tais como:
- O uso de glutamina muda à medida que as células progridem de não malignas para malignas. (1)
- Um intermediário no catabolismo de aminoácidos impulsiona a captação de ácidos graxos pelas células endoteliais. (2)
- O núcleo e o citosol usam diferentes fontes de carbono para modificações proteicas. (3)
Uma dessas técnicas é o rastreamento metabólico, no qual uma molécula de interesse recebe um rótulo específico (mais sobre isso mais tarde) e, assim, torna-se “rastreável” através de uma variedade de métodos, incluindo:
- Detecção de um rótulo de isótopo radioativo usando um analisador de cintilação.
- Detecção de um rótulo de isótopo estável usando espectrometria de massa ou RMN.
O rastreamento metabólico permitiu a descoberta de uma nova biologia elementary com implicações importantes para a saúde humana.
Por exemplo, a rotulagem da frutose mostrou que o intestino delgado, e não o fígado, é na verdade o principal native de depuração da frutose e ajuda a proteger o fígado dos efeitos potencialmente tóxicos da frutose. (4)
Ou que a nicotinamida ribose oral, um precursor do NAD e suplemento comumente consumido, na verdade contribui para a síntese do NAD através do microbioma intestinal. (5)
O que o rastreamento metabólico pode me ajudar a aprender?
O rastreamento metabólico pode ajudá-lo a responder todos os tipos de perguntas que você possa ter sobre seu sistema biológico, incluindo (mas não limitado a!):
- Quais nutrientes fornecem combustível para uma determinada função celular, como a acetilação de proteínas.
- Como as perturbações ambientais, como a hipóxia, alteram o uso de nutrientes pela célula ou organismo.
- Se as mudanças no consumo de nutrientes têm consequências funcionais, como a capacidade proliferativa celular.
- Por que certos tipos de células podem preferir um nutriente a outro, ou seja, para que fazem esses nutrientes preferidos.
- Onde os nutrientes estão sendo consumidos e como isso pode mudar sob condições patológicas.
O que o rastreamento metabólico pode me dizer que a metabolômica não pode?
O growth de ‘abordagens baseadas em ômicas deu origem a milhares de conjuntos de dados metabolômicos. (6)
O apelo da metabolômica é compreensível- informações sobre milhares de metabólitos diferentes, todos provenientes de um único experimento. (7)
Muitas vezes, porém, acompanhar questões interessantes geradas a partir de dados metabolômicos torna-se um desafio.
O maior problema na interpretação de dados metabolômicos é que a metabolômica oferece uma imagem estática de um sistema dinâmico. (8) Os metabólitos são constantemente produzidos e consumidos por uma rede incrivelmente complexa de reações enzimáticas.
Se um determinado metabolito aparece regulado positivamente ou negativamente nos dados metabolómicos, é impossível dizer qual o processo que está a impulsionar a mudança – produção ou consumo de metabolitos.
Por exemplo, digamos que você notice que os níveis de glicose plasmática estão aumentados em um grupo de tratamento em comparação com um grupo de controle. O aumento dos níveis de glicose é devido ao aumento da produção de glicose ou à diminuição do consumo de glicose?
Entre no rastreamento metabólico! O rastreio metabólico permite-nos responder a questões sobre a origem de um determinado metabolito (produção) e para onde vai (consumo).
Ao rotular átomos individuais num determinado metabolito de interesse, podemos acompanhar o destino destes átomos ao longo do tempo e através de caminhos, dando-nos uma compreensão dinâmica de um sistema dinâmico.
Os dados metabolômicos por si só fornecem uma história incompleta, e o rastreamento metabólico ajuda a preencher essa lacuna medindo a atividade da through.
Isótopos. O que são e o que os torna estáveis?
Então agora você está convencido e quer fazer um rastreamento metabólico. Para configurar, executar e interpretar seus experimentos, você precisa saber o que são isótopos.
Simplificando, os isótopos são formas diferentes do mesmo elemento químico.
Os átomos consistem em prótons, nêutrons e elétrons. Prótons e nêutrons constituem o núcleo de um átomo, enquanto os elétrons equilibram a carga positiva dos prótons e orbitam o núcleo. Os nêutrons não carregam carga.
Os isótopos de um determinado elemento têm o mesmo número de prótons, mas um número diferente de nêutrons, portanto, têm massas diferentes.
Por exemplo, o hidrogênio possui 3 isótopos que ocorrem naturalmente, com 0, 1 e 2 nêutrons (Figura 1).
Figura 1. Os 3 isótopos naturais de hidrogênio. Da esquerda para a direita: hidrogênio, deutério e trítio. (Crédito da imagem: Biorender. com).
Você deve ter ouvido isótopos ou traçadores de isótopos serem chamados de “estáveis”, o que significa simplesmente isótopos não radioativos.
Por outro lado, os isótopos radioativos são instáveis. Eles decaem para um isótopo estável emitindo radiação na forma de:
- Radiação alfa (um aglomerado de dois prótons e dois nêutrons).
- Radiação beta (um elétron ou um pósitron).
- Radiação gama (uma onda eletromagnética de alta energia e comprimento de onda curto).
Embora os traçadores de isótopos radioativos (ou “quentes”) costumavam ser preferidos por sua alta relação sinal-ruído, os isótopos estáveis são agora amplamente utilizados devido ao seu excelente perfil de segurança.
Como os isótopos estáveis são usados no rastreamento metabólico?
Os traçadores de isótopos metabólicos são fisiologicamente indistinguíveis dos metabólitos endógenos (metabólitos produzidos naturalmente pelo organismo), mas detectáveis por espectrometria de massa.
Embora muitos átomos diferentes possam ser marcados com traçadores isótopos, os mais comuns em aplicações metabólicas são carbono, nitrogênio e hidrogênio.
Por exemplo, os carbonos da glicose podem ser “13C” isótopo em vez de “12C”, tornando-os um pouco mais pesados.
Primeiro, devemos introduzir nosso traçador isotópico metabólico em nosso sistema biológico. Isso pode ser feito por:
In vivo
- Infusão intravenosa.
- Injeção (ex. Intraperitoneal).
- Entrega oral (gavagem, comida, água).
In vitro
- Perfusão (ex. técnica de Langendorff).
- Incubação (meios de cultura celular, tampões, and so on.)
Depois de introduzir nosso traçador, podemos rastrear nosso átomo marcado à medida que ele sofre conversões enzimáticas metabólicas.
Seguindo nosso exemplo da glicose, podemos verificar se nossos carbonos marcados eventualmente chegaram ao lactato ou possivelmente aos estoques de lipídios (Figura 2).
Figura 2. Exemplo de rastreamento de carbonos rotulados de um 13Rastreador C-Glicose em lactato e ácidos graxos (crédito da imagem: Biorender. com).
Considerações cruciais para projetar um experimento de rastreamento metabólico
Qual átomo eu quero seguir
Certifique-se de que o átomo rotulado que você usa participa das vias metabólicas de seu interesse. Por exemplo, você não gostaria de rotular um carbono em uma molécula que se “perderia” como CO2 antes de atingir o metabólito de interesse a jusante.
Quão sensíveis são minhas capacidades de detecção?
Conhecer a faixa de sensibilidade do seu método de detecção ajudará a orientar questões de projeto experimental, como concentração e taxa de entrega de isótopos.
Devo me preocupar com perturbações da fisiologia endógena?
Se a entrega do seu isótopo for muito baixa, você não será capaz de detectá-lo (veja “Quão Sensíveis São Minhas Capacidades de Detecção”), mas se você mirar muito alto, você corre o risco de perturbar o metabolismo endógeno, daí a importância de experimentos piloto para equilibrar essas duas considerações.
Quais são a cinética dos meus processos biológicos de interesse?
As vias metabólicas podem operar em escalas de tempo muito diferentes e, portanto, requerem períodos variados de exposição ao traçador isotópico para acumular produtos detectáveis. (9) Por exemplo, a detecção de marcadores em proteínas sintetizadas exigiria um experimento muito mais longo do que a detecção de lactato produzido pela glicólise.
Estou interessado na taxa de um caminho e quais nutrientes alimentam um caminho
Em outras palavras, você está interessado em saber qual combustível o motor está queimando ou com que rapidez ele está queimando. Responder a essas perguntas requer diferentes estratégias de rastreamento.
Identifiquei variáveis de confusão?
Como todo experimento, é importante considerar fatores que podem complicar a interpretação dos resultados da rotulagem. Por exemplo, a glicose marcada com carbono pode ser convertida em lactato antes de entrar nas vias oxidativas, tornando-o incapaz de distinguir se os carbonos marcados vieram diretamente da glicose ou do lactato derivado da glicose. (10)
Resumo
Quando cuidadosamente planejados, os experimentos de rastreamento metabólico permitem o rastreamento direto de átomos através de vias metabólicas através da detecção de diferenças em massa.
Este sistema de rastreamento ajuda a responder perguntas sobre sistemas biológicos altamente dinâmicos que outras técnicas, como a metabolômica, não conseguem.
Pensar na cinética, sensibilidade e propriedades do seu sistema biológico de interesse pode ajudar a orientar seu projeto experimental.
Depois de mergulhar no rastreamento metabólico, você pode começar a pensar em aplicativos mais avançados, como espectro de massa de imagem. (11)
Se você tem experiência com rastreamento metabólico, compartilhe na seção de comentários suas melhores dicas para um projeto experimental bem-sucedido ou seus recursos favoritos para orientar a interpretação dos dados de rastreamento!
Referências
1. Gonsalves WI, Jang JS, Jessen E, Hitosugi T, Evans LA, Jevremovic D, Nair KS e outros. (2020). In vivo avaliação da anaplerose da glutamina no ciclo do TCA em células plasmáticas clonais humanas pré-malignas e malignas. Metab do câncer. 8:1-17
2. Jang C, Oh SF, Wada S, Rowe GC, Liu L, Chan MC, Arany Z e outros. (2016). Um metabólito de aminoácido de cadeia ramificada impulsiona o transporte vascular de ácidos graxos e causa resistência à insulina. Nat med. 22(4):421–26
3. Trefely S, Huber Okay, Liu J, Noji M, Stransky S, Singh J, Snyder NW (2022). A análise quantitativa subcelular de acil-CoA revela metabolismo nuclear distinto e propionilação de histonas dependente de isoleucina. Célula Mol. 82(2):447–62
4. Jang C, Hui S, Lu W, Cowan AJ, Morscher RJ, Lee G, Liu W, Tesz GJ, Birnbaum MJ, Rabinowitz JD (2018). O intestino delgado converte a frutose da dieta em glicose e ácidos orgânicos. Metab celular. 27(2):351–61.e3
5. Chellappa, Okay, McReynolds MR, Lu W, Zeng X, Makarov M, Hayat F, Baur JA e outros. (2022). Os precursores de NAD circulam entre os tecidos do hospedeiro e o microbioma intestinal. Metab celular. 34(12):1947–59
6. Aprenda ômica! O que é esse “Omics” que continuo tropeçando? Disponível em: https://bitesizebio.com/24629/learn-omics-what-is-that-omics-i-keep-stumbling-upon Acessado em 15 de junho de 2024
7. A Importância da Pesquisa Metabolômica. Disponível em: https://bitesizebio.com/31115/importance-metabolomics Acessado em 15 de junho de 2024
8. Jang C, Chen L, Rabinowitz JD. (2018). Metabolômica e rastreamento de isótopos. Célula 173(4):822–37
9. Bartman CR, TeSlaa T, Rabinowitz JD. (2021). Análise quantitativa de fluxo em mamíferos. Metab Nat. 3(7):896–908
10. Hui S, Ghergurovich JM, Morscher RJ, Jang C, Teng X, Lu W, Esparza, LA, Reya T, Zhan L, Yanxiang Guo J, White E, Rabinowitz JD. (2017). A glicose alimenta o ciclo do TCA através do lactato circulante. Natureza. 551(7678):115–18
11. Como escolher sua matriz MALDI (Alma). Disponível em: https://bitesizebio.com/27800/how-to-choose-your-maldi-soul-matrix Acessado em 15 de junho de 2024
