Como preparar géis Bis-Tris e por que eles são tão bons!

Faixas manchadas em seu gel SDS-PAGE são dignas de nota.

Até porque executar uma SDS-PAGE demora um pouco e sempre parece ser a última coisa que você faz. Nota ruim para terminar o dia quando o seu gel não responder à sua pergunta!

E obter uma faixa manchada geralmente significa que você não consegue responder à pergunta que deseja. Ótimo.

Este artigo explica um truque interessante: usar géis Bis-Tris para obter bandas mais nítidas e de alta resolução.

Discutiremos as vantagens de usar géis Bis-Tris, consideraremos quando faz sentido e explicaremos como lançá-los.

O que é um gel Bis-Tris?

Os géis Bis-Tris são outro tipo de gel que você pode usar na eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), junto com os géis SDS-PAGE regulares e os géis PAGE nativos, para separar proteínas.

O pKa de Bis-Tris (tecnicamente chamado de metano Bis-Tris) é 6,5 a 25°C, em comparação com um pKa de 8,1 para a base tris common.

A faixa de buffer ideally suited para géis Bis-Tris é ~ 5,8–7,2

Assim, os géis Bis-Tris são executados em pH neutro ou levemente ácido, em contraste com as condições alcalinas utilizadas em Géis SDS-PAGEtornando-os adequados para separar proteínas que são mais estáveis ​​ou melhor resolvidas neste pH.

Condições ácidas também podem ajudar a suprimir a reoxidação da cisteína, evitando que as proteínas se reticulem through dissulfeto no gel, mas é claro, você sempre pode incluir um agente redutor para evitar isso (veja mais adiante).

Apenas tome cuidado, pois o Bis-Tris é um agente quelante e se liga fortemente a cátions metálicos comuns que você usa durante a expressão e análise de proteínas, como zinco, cálcio, cobalto e níquel.

Vantagens dos géis Bis-Tris

Embora usar Bis-Tris em vez de tris torne o preparo dos seus géis mais caro, eles têm dois principais:

1. Você obtém melhor resolução, aprimorando suas bandas de proteína
2. Eles geralmente exibem menor coloração de fundo do que os géis normais

Não parece muito, mas juntos, eles podem ter um grande impacto benéfico em seus experimentos e análises, especialmente se você considerar a quantidade de análises para as quais usamos o PAGE.

Quando é uma boa ideia usá-los?

Se você pensar nas vantagens listadas acima, pode ser uma boa ideia usar géis Bis-Tris quando:

1. Você pretende fazer um Western Blot
2. Você está estudando diferentes formas de proteínas, todas com tamanhos semelhantes
3. Você precisa resolver um monte de bandas de baixo peso molecular
4. Sua amostra é conhecida por produzir bandas manchadas (por exemplo, proteínas hidrofóbicas)
5. Você precisa de uma imagem realmente bonita de um gel com lindas faixas nítidas

Se você quiser ver o processo de fazer um Western blot usando um resultado de gel Bis-Tris, ou geralmente ver como outros laboratórios estão configurando seu sistema de gel Bis-Tris, confira este artigo no Jornal de Experimentos Visuais. (1)

Sua receita de gel Bis-Tris

Veja como fazer um gel Bis-Tris. O método não é muito diferente dos métodos convencionais de moldagem de géis de proteína.

Simplesmente substitua o tampão tris no gel de resolução pelo Bis-Tris buffer em pH 6,4 (ou qualquer pH que você exact, desde que esteja dentro da faixa de buffer mencionada acima).

Você pode usar uma concentração mais baixa de Bis-Tris em comparação com a concentração de tris que você normalmente usaria. Cerca de 30% menos para ser mais preciso.

Por que?

Tem a ver com a faixa de buffer do Bis-Tris mencionada acima. Sua faixa de tamponamento efetiva é muito mais estreita que a do tris (pH 7–9), portanto, você precisa de menos moléculas de Bis-Tris para manter o pH.

Você vai querer mantenha tris regulares em seu gel de empilhamento (geralmente presente em torno de pH 6,8), pois ainda precisamos do mesmo ambiente químico para empilhar as proteínas na matriz da amostra antes de resolvê-las.

A Tabela 1 abaixo fornece uma receita prática de gel Bis-Tris.

Tabela 1. Receita de gel Bis-Tris.

E a Tabela 2 informa qual porcentagem de gel usar (quanta acrilamida incluir) dependendo do peso molecular (PM) da sua proteína alvo.

Tabela 2. Resumo de quais tamanhos de proteínas os géis SDS-PAGE podem resolver quando preparados com 8–20% de acrilamida.

Bitesize Bio tem um prático protocolo de moldagem de gel, que você pode ler aqui.

Incluir MES ou MOPs em seu buffer em execução

Outra diferença importante ao executar géis Bis-Tris é que você inclui MES ou MOPS no seu buffer de execução em vez de glicina.

Os ânions MES ou MOPS (os carregados negativamente) servem como íons finais no sistema tampão em execução, enquanto o triscátion (carregado positivamente) serve como o íon principal.

Se você não tiver certeza do que significam os íons “iniciais” e “finais” na linguagem SDS-PAGE, você pode ler sobre como o SDS-PAGE funciona aqui. De qualquer forma:

• Use MES quando quiser separar proteínas de baixo peso molecular (≤50kDa)
• Use MOPs quando quiser separar proteínas de alto peso molecular (≥50kDa)

A tabela a seguir informa como preparar esses buffers.

Tabela 3. Receita para MES e MOPs executando buffers para SDS-PAGE usando géis Bis-Tris.

Observe que se você estiver preparando esses estoques tampão para um laboratório inteiro, poderá produzi-los com uma resistência de 20x multiplicando tudo por 4 – eles durarão um pouco mais.

Adicione bissulfito de sódio, um agente redutor suave, a uma concentração de 5 mM no tampão de corrida antes de cada corrida. É uma boa ideia fazer isso com um estoque de 1 milhão.

Configure seu sistema SDS-PAGE com seus géis Bis-Tris exatamente como faria com qualquer outro SDS-PAGE e execute-os em uma velocidade tensão constante de 150V.

Fora isso, tudo é igual. Leia este artigo se precisar de conselhos detalhados sobre como executar sua eletroforese.

Tomando o Bis. Fazendo seus próprios géis Bis-tris resumidos

E esses são os géis Bis-Tris em seu repertório experimental. Você pode separá-los quando souber que precisa de um gel importante ou se começar a trabalhar com uma amostra difícil de resolver.

Se você quiser se aprofundar nos buffers e em como eles funcionam, confira nosso webinar “Tudo o que você precisa saber sobre buffers.”

Publicado originalmente em 12 de setembro de 2008. Atualizado e revisado em julho de 2016 e outubro de 2024.

Referência

1. Penna A, Cahalan M. (2007). Western Blotting usando minigéis Invitrogen NuPage Novex Bis Tris. J Vis Exp. 7:264

Bala é uma estudante de pós-graduação na Alemanha. Ele adora tecnologia e pode ser frequentemente encontrado na blogosfera e na web. Seu tempo livre é consumido por fotografia e livros.