Trabalhar com proteínas de membrana pode ser complicado porque elas não são solúveis em água e muitas vezes perdem atividade quando removidas da membrana celular. Isolá-los para investigação pode ser uma odisseia repleta de desafios.
Esperamos que este artigo possa ajudá-lo a superar alguns dos problemas mais comuns associados a esse objetivo.
Principais dicas para expressar proteínas de membrana
Ao trabalhar com proteínas de membrana, o primeiro passo geralmente é expressá-las. E embora possa ser uma tarefa difícil, não é intransponível. Aqui estão algumas dicas para ajudá-lo a seguir em frente.
Mude suas células competentes
Arquive os BL21s e experimente o C41 (DE3) competente E. coli células em vez disso. Esta cepa contém algumas mutações pontuais no promotor lacUV5 para reduzir a taxa de transcrição. Assim, por razões bastante complicadas, eles são ótimos para expressar proteínas tóxicas devido à taxa de expressão reduzida ser mais suave para as células hospedeiras.
Você também pode experimentar células C43(DE3) ou Lemo21(DE3), pois oferecem benefícios semelhantes. (1)
Use um meio de crescimento mínimo
Contra-intuitivamente, o uso de meios de crescimento bacteriano não ricos, como o meio mínimo M9, pode melhorar a expressão da sua amostra. A razão para isso também está relacionada à toxicidade. A teoria diz que a redução da taxa de crescimento celular reduz a probabilidade de erros de dobramento de peptídeos na membrana celular.
Na prática, quando experimentei o M9 e um meio mais rico, como o Terrific Broth, o M9 dá pelo menos os mesmos rendimentos que a amostra expressa.
Tente expressar homólogos
Você ainda está tentando expressar uma amostra que simplesmente não está aparecendo no seu Géis SDS-PAGE? Considere expressar um gene homólogo de outra espécie ou gênero.
As diferenças sutis na sequência primária podem proporcionar melhorias significativas na estabilidade proteicao que, surpresa surpresa, beneficia não apenas a expressão da amostra, mas também a estabilidade in vitro.
Adicione uma etiqueta de solubilidade
Uma etiqueta de solubilidade é uma sequência de aminoácidos adicionais adicionados à proteína alvo. Quando escolhidas adequadamente, essas tags podem oferecer melhorias significativas no rendimento da expressão e na estabilidade da amostra. Melhor ainda, a tecnologia é compatível com proteínas de membrana, por isso considere adicionar uma.
A Proteína Fluorescente Verde é uma escolha comum porque permite detectar sua amostra em cada etapa usando fluorescência. A criatividade é recompensada nesta fase, e se você precisar de alguma inspiração, os receptores acoplados à proteína G são frequentemente purificados com unidades de lisozima solúveis em água fundidas em uma alça de membrana additional. (2)
Extraindo sua proteína de membrana da membrana celular
Agora é hora de pensar em como você deseja retirar sua amostra da membrana celular usando um agente solubilizante que seja compatível com seus experimentos posteriores.
Suas escolhas aqui são detergente, nanodisco ou polímero lipídico.
Extraindo com Detergentes
Os detergentes são de longe a escolha mais comum, mas proporcionam um ambiente químico (uma micela de detergente) diferente de uma membrana celular. É, portanto, mais provável que quebrem a estrutura quaternária e interrompam a função da proteína da membrana.
Apesar disso, eles são ótimos para cristalografia de raios X porque as micelas que formam são menores que os polímeros lipídicos e os conjuntos de nanodiscos. Portanto, eles fornecem uma amostra mais homogênea, o que é um pré-requisito para cristalização de proteínas.
Se você usar um detergente, mantenha-o presente em uma concentração que seja aproximadamente 100x sua Concentração Micelar Crítica (CMC). Você deve encontrar essas informações no web site do fornecedor. Você pode leia sobre CMCs aqui (3) e saiba mais sobre usando detergentes para solubilizar e cristalizar proteínas de membrana aqui.
Extração com Nanodiscos e Polímeros Lipídicos
Nanodiscos e polímeros envolvem seções inteiras da membrana celular, com a proteína da membrana incorporada nela. Assim, você leva todos esses lipídios nativos durante o passeio, o que os torna ótimos para ensaios funcionais.
É mais provável que você seize o estado de oligomerização nativo do seu alvo, mas o tamanho do complexo resultante pode não ser compatível com todos os experimentos.
Dê um tempo e mantenha-o aquecido
Qualquer que seja o reagente usado para extrair a amostra da membrana celular, aguarde bastante tempo para que o processo ocorra. Três horas é bom, mas durante a noite é melhor. Além disso, não tenha medo de aquecer um pouco a mistura.
Você pode descobrir que a extração é muito mais eficiente a 20–30°C do que a 4°C devido ao aumento do movimento térmico. Apenas verifique se isso não prejudica sua amostra.
Dicas para purificação de proteínas de membrana usando cromatografia de afinidade de níquel
Agora que você retirou sua amostra da membrana celular, basta purificá-la e pronto. Aqui estão mais algumas dicas.
Use uma resina solta
Quando se trata de purificação de proteínas de membrana, a maioria das pessoas começa com cromatografia de afinidade com níquel. Se a ‘maioria das pessoas’ inclui você, certifique-se de usar uma resina solta em vez de uma coluna estática, porque o que quer que esteja solubilizando sua amostra geralmente é grande o suficiente para esconder sua etiqueta de afinidade.
Uma única passagem por uma coluna estática não é longa o suficiente para permitir a ligação da tag de afinidade. E todos sabemos que nenhuma ligação leva a cientistas insatisfeitos.
Uma resina solta pode ser misturada fisicamente com sua amostra para estimular a ligação. Novamente, é aconselhável aguardar várias horas para que esse processo ocorra.
Dica profissional: se você não tiver acesso à resina solta, passe a amostra pela coluna repetidamente usando um circuito fechado em uma bomba peristáltica.
Diluir o Agente Solubilizante
Você também pode dar à sua amostra uma melhor probability de ligação à coluna diluindo-a (pelo menos 2 vezes) para diluir o agente solubilizante.
Esses agentes são geralmente tão grandes que são excelentes agentes de crowding e fazem um trabalho brilhante ao ocultar tags de afinidade. Isto, novamente, pode levar à redução da ligação.
Ajuste sua tag de afinidade
Ainda não se liga à coluna mesmo depois de um dia de mistura? Considere mover sua tag de afinidade para o terminal oposto. Pode ser que aquele que você escolheu esteja enterrado dentro do estrutura terciária.
Também consegui alongar a etiqueta de afinidade, passando de 6× His para 12× His. Você também pode clonar alguns resíduos arbitrários para afastar sua etiqueta da superfície da proteína.
Carregue sua resina de afinidade com cobalto
Você está lutando com uma amostra impura? Você poderia carregar sua resina com afinidade de níquel com cobalto que, devido ao menor número de estados de oxidação que adota, aumentará a pureza às custas da recuperação da amostra. (4,5)
A cromatografia de exclusão de tamanho pode proporcionar maior pureza, mas seja cauteloso
Se você precisar de mais pureza, cromatografia de exclusão de tamanho com detecção UV funcionará, mas o agente solubilizante adiciona uma massa significativa à sua amostra e pode ter um formato engraçado. Isto significa que, ao contrário das proteínas citoplasmáticas, não é possível determinar o peso molecular e o estado oligomérico da sua amostra a partir do cromatograma (lembre-se de que a exclusão de tamanho separa as moléculas com base no seu raio hidrodinâmico).
A melhor maneira de obter uma janela para a distribuição do tamanho da amostra é usar o espalhamento dinâmico de luz, que fornece um resultado muito mais preciso.
Os detergentes também podem interagir com a fase estacionária da coluna, ampliando significativamente o pico da amostra. Isso significa que é mais provável que espécies contaminantes coeluam com sua amostra. Você pode atenuar isso carregando sua amostra na coluna no menor quantity possível ou trocando o detergente por um que não interaja com a coluna ou forme micelas menores.
Considerações finais sobre como trabalhar com proteínas de membrana
A obtenção desses alvos complicados requer uma combinação de habilidade, paciência e determinação. Já que começamos com uma alusão heróica, terminemos com uma também:
“Esforçar-se, procurar, encontrar e não ceder.”(6)
Leve o seu jogo de purificação de proteínas para o próximo nível com nossos dois e-books gratuitos: O Guia Bitesize Bio para Expressão de Proteínas e Cinco métodos para avaliar a pureza e qualidade das proteínas.
Você tem alguma dica adicional para trabalhar com proteínas de membrana? Deixe um comentário abaixo se sim.
Referências
1. Wagner S. e outros. (2008) Afinação Escherichia coli para superexpressão de proteínas de membrana. PNAS 105:14371–6
2. Thorsen TS e outros. (2014) Proteínas de fusão de lisozima T4 modificadas facilitam a cristalogênese do receptor acoplado à proteína G. Estrutura 22:1657–64
3. Sigma Aldrich. Propriedades e aplicações do detergente. Acessado em maio de 2021
4. TakaraBio. Obtenha a mais alta pureza com resina de cobalto. Acessado em maio de 2021
5. Cubo Biotecnologia. NTA versus IDA: qual a diferença? Acessado em maio de 2021
6. Fundação de Poesia. e Ulisses por Alfred, Lord Tennyson. Acessado em maio de 2021
