Enrugamento extremo da lâmina nuclear é um marcador morfológico de câncer

Duas perguntas

A atipia nuclear é uma característica definidora e útil para o diagnóstico de muitos tipos de câncer. A atipia nuclear inclui características como formato nuclear irregular, tamanho e distribuição de heterocromatina, entre outras características¹. A atipia nuclear é geralmente determinada qualitativamente pelo exame visible de amostras de tecido coradas com hematoxilina e eosina (H&E). Esta abordagem qualitativa introduz inevitavelmente variabilidade inter e intrapatologista nas avaliações da atipia nuclear. Como tal, há necessidade de medições quantificáveis ​​e imparciais de atipias nucleares.

A causa da atipia nuclear no câncer não é totalmente compreendida. Estudos de mecânica nuclear mostraram que a lâmina nuclear, uma estrutura subjacente ao envelope nuclear, ajuda a determinar a forma do núcleo. Estes estudos são geralmente realizados em cultura de células 2D, onde a lâmina nuclear é suavizada porque o núcleo é achatado pela disseminação celular. Quando as células são impedidas de se espalhar, a lâmina assume uma aparência enrugada. Dado que as células estão menos espalhadas in vivo do que nas superfícies planas da cultura 2D, a lâmina nuclear in vivo pode estar enrugado em vez de liso. Esta é uma característica do recente “modelo de queda” nuclear proposto pelos laboratórios Lele e Dickinson. O modelo postula que as rugas que aparecem quando um núcleo é arredondado – ou seja, quando sua forma se aproxima de uma esfera – são uma manifestação do “excesso de área superficial” da lâmina sobre a área de uma esfera do quantity do núcleo.². Esta área laminar excessiva, que se desenvolve pós-mitose em torno de cromossomos irregularmente compactados³permite que os núcleos assumam diversas formas com pouca resistência mecânica⁴. O núcleo torna-se ‘rígido’ para mudar de forma apenas quando é achatado e a lâmina é lisa e esticada, após o que resiste à extensão⁵.

Neste trabalho, procuramos testar os aspectos acima do modelo de gota em tecidos de pacientes. Combinamos nossos interesses em mecanobiologia nuclear e patologia neste artigo, para responder a estas questões: (1) A maioria dos núcleos dos tecidos dos pacientes está enrugada e essas rugas facilitam diversas formas nucleares, conforme previsto pelo modelo de gota? e (2) O enrugamento laminar nuclear é um marcador morfológico quantificável de câncer?

Nossas descobertas

Para responder a essas perguntas, imunocoramos tecidos de pacientes para a lâmina nuclear e os visualizamos em alta resolução. Rugas laminares nucleares estavam presentes tanto no tecido controle quanto no tecido canceroso, de cabeça e pescoço, pele, ovário, mama, cólon e tecidos da tireoide (ver Figura 1 para exemplos de enrugamento nuclear). O enrugamento nuclear não period visível nos tecidos corados com H&E.

Houve uma exceção no carcinoma ductal mamário in situ (CDIS) puro, que apresentava muitos núcleos lisos, diferentemente de outros tipos de tecidos. Usámos esta diferença para avaliar a segunda parte da nossa primeira questão: as rugas nucleares permitem diversas formas nucleares? Comparamos os núcleos do CDIS com os núcleos mais enrugados do carcinoma invasivo da mama e descobrimos que as formas nucleares eram de fato mais diversas no carcinoma invasivo da mama.

A natureza quase onipresente das rugas nucleares exigiu testes para determinar se poderiam ser artefatos de processamento de tecidos. Utilizamos tecido fixado em formalina e embebido em parafina (FFPE) para este estudo. Este tipo de tecido é difundido em patologia, mas requer etapas de processamento intensas para imunocoloração: lavagens com xileno e etanol, reidratação e recuperação de antígeno (um método baseado em calor e pH para reduzir a reticulação extensa da fixação em formalina de 24 a 48 horas) . Portanto, também imunocoramos o tecido congelado do paciente para a lâmina nuclear em busca de rugas nucleares, pois possui etapas de processamento diferentes e em menor número. Rugas nucleares também estavam presentes neste tecido. Além disso, realizamos alguns controles internos no tecido FFPE.

Uma vez convencidos de que as rugas nucleares no controle e o tecido canceroso não eram artefatos do processamento tecidual, perguntamos se a extensão e/ou tipo de enrugamento estava alterado no câncer e poderia ser aproveitado como um marcador morfológico. Para testar isso, classificamos visualmente os núcleos com base em seu enrugamento em quatro courses: núcleos lisos sem rugas, núcleos com variações de contorno de baixa frequência, núcleos com variações de contorno de alta frequência e núcleos com rugas internas (veja a Figura 2 para exemplos de núcleos nestes categorias). Consideramos que as duas últimas courses são exemplos de enrugamento nuclear extremo.

Para evitar o viés inerente às avaliações qualitativas de enrugamento nuclear, usamos a aprendizagem por transferência para empregar um modelo de aprendizagem profunda ResNet50 pré-treinado⁶ para classificar núcleos de amostras de pacientes. Cortamos núcleos individuais de nossas imagens de tecidos de pacientes e restringimos a análise aos núcleos de células que expressam pan-citoqueratina, de modo que apenas células epiteliais de carcinoma e controle foram consideradas.

A execução de milhares de imagens de núcleos através deste modelo revelou que a ondulação do contorno de baixa frequência period o tipo de enrugamento mais comum em cada tecido, reforçando a nossa descoberta de que a maioria dos tecidos tinha núcleos enrugados. Além disso, nossa análise demonstrou que os tecidos de pacientes com câncer tendiam a ter núcleos mais extremamente enrugados do que os tecidos de controle. Além disso, a quantidade de núcleos extremamente enrugados tendeu a ser maior em casos com maior grau de câncer e envolvimento de linfonodos.

Para verificar nossos resultados de aprendizado profundo, realizamos análise de Fourier dos contornos nucleares⁷. Adaptamos um método de segmentação personalizado⁸ para capturar variações micron e submicron no contorno nuclear para esse fim, já que os métodos de segmentação mais comuns suavizaram as variações de contorno de alta frequência claramente visíveis na lâmina nuclear. Esta análise confirmou as nossas descobertas de aprendizagem profunda – o contorno nuclear period mais irregular nos tecidos cancerígenos em comparação com os tecidos de controlo.

Testamos três possíveis causas de enrugamento nuclear extremo: perda de lamina A/C no câncer⁹a presença de fibras de actina perinucleares¹⁰e localização em aglomerados de células cancerosas: mas nenhum desses fenômenos explicou satisfatoriamente a prevalência de rugas nucleares extremas. É possível que o arredondamento celular ocorra em tecidos cancerígenos devido a uma perda geral da estrutura do tecido que promove núcleos mais arredondados e, portanto, enrugados.¹¹mas testar essa hipótese requer imagens 3D de células em tecidos mais espessos. Este trabalho está atualmente em andamento no laboratório.

No geral, os nossos dados indicam que as rugas nucleares são uma característica do tecido humano – tanto regular como canceroso – consistente com o modelo de queda nuclear. No entanto, o enrugamento laminar nuclear extremo é um marcador morfológico do tecido canceroso. A detecção de enrugamento laminar com abordagens de IA poderia melhorar a precisão do diagnóstico e prognóstico do câncer.

Leia mais aqui: Wang, TC., Dollahon, CR, Mishra, S. e outros. O enrugamento extremo da lâmina nuclear é um marcador morfológico de câncer. npj Preciso. Uma vez. 8, 276 (2024). https://doi.org/10.1038/s41698-024-00775-8

Múltiplos colaboradores: Tanmay P. Lele também contribuiu para esta postagem.

Referências:

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2. Dickinson, RB & Lele, TP As formas nucleares são determinadas geometricamente pelo excesso de área superficial da lâmina nuclear. Desenvolvimento de célula frontal. Biol. 111058727 (2023).

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4. Dickinson, RB & Lele, TP Uma nova função para laminas nucleares: fornecer tensão superficial à gota nuclear. Curr. Opinião. Biomédica. Eng. 28, https://doi.org/10.1016/j.cobme.2023.100483 (2023).

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