5.7 C
Nova Iorque
quinta-feira, novembro 14, 2024

O papel da sinalização WNT após lesão em células-tronco intestinais


Durante o verão, tive a oportunidade de realizar pesquisas no Laboratório de Vivian Li, com foco no papel da sinalização WNT na resposta das células-tronco intestinais a lesões, sob a orientação especializada do Dr. Estou profundamente grato pela oportunidade de adquirir experiência prática em pesquisa elementary através da realização de um projeto ao longo de dois meses. Estou verdadeiramente inspirado pela inovação contínua no Instituto Francis Crick, impulsionada por uma comunidade diversificada de cientistas comprometidos que adotam abordagens colaborativas e interdisciplinares.

Um eixo de pesquisa dentro do Li Lab concentra-se em como a sinalização canônica WNT mantém as células-tronco intestinais (ISCs) e influencia a decisão do destino celular. O epitélio intestinal pode ser organizado em uma arquitetura de criptas e vilosidades (Fig. 1A). As criptas são encontradas na base, estendendo-se pelas vilosidades em direção ao lúmen intestinal. As ISCs estão localizadas dentro da cripta e são responsáveis ​​por impulsionar a renovação do epitélio intestinal a cada 3-5 dias durante a homeostase. A alta sinalização WNT nas criptas mantém a homeostase do ISC antes de diminuir ao longo de um gradiente em direção às vilosidades. Publicações demonstraram que embora a inibição dos sinais WNT trigger degeneração, a superativação do WNT induz a formação de adenoma. Portanto, a sinalização WNT ajustada é essential para manter a homeostase do ISC.

Figura 1. A) Epitélio intestinal durante a homeostase. B) Modelo de lesão intestinal. Camundongos repórteres TCF/Lef:H2B:mCherry foram expostos a 12Gy de radiação CSM de corpo inteiro. Criptas intestinais ou isoladas foram coletadas em 0 dpi (controle pré-irradiação), 1 dpi, 3 dpi e 7 dpi.

Para este projeto, examinei o papel da sinalização WNT em ISCs durante a regeneração induzida por lesões. Utilizamos irradiação de corpo inteiro para simular a regeneração induzida por lesão ISC em camundongos. Este modelo resulta na degeneração das criptas em 1 dia pós-irradiação (dpi), seguida de regeneração em 3 dpi e recuperação em 7 dpi (Fig. 1B). Os tecidos intestinais foram colhidos para isolamento de criptas em quatro momentos: 0 dpi (controle pré-irradiação), 1 dpi, 3 dpi e 7 dpi. Essas amostras foram então usadas para investigar três assinaturas transcricionais ao longo do processo regenerativo: células-tronco intestinais clássicas (ISC), células-tronco de renascimento (RevSC) e genes alvo WNT.

Realizei PCR quantitativo (qPCR) para analisar as mudanças temporais na expressão gênica durante o processo regenerativo (Fig. 2). Os resultados indicaram que os marcadores ISC clássicos foram regulados negativamente em 1 dpi após a lesão e recuperaram para níveis quase homeostáticos em 7 dpi. Os marcadores RevSC mostraram uma indução em 1 dpi, seguida por um declínio em direção aos níveis basais em 7 dpi. Curiosamente, a expressão do gene alvo WNT permaneceu relativamente estável durante o período de 7 dias.

Figura 2. Análise qPCR de criptas isoladas de 0, 1, 3 e 7 dpi. UM) Os marcadores Classis ISC (Lgr5, Olfm4) diminuem após lesão em 1 dpi, mas recuperam perto dos níveis homeostáticos em 7 dpi. B) Os marcadores RevSC (Trop2, Anxa1, Clu, Sca1) aumentam após lesão em 1-3dpi e 3/4 dos alvos recuperam de volta aos níveis homeostáticos em 7dpi. C) A maioria dos genes alvo WNT (3/4) permanecem constantes em todos os momentos. Um alvo, Cd44, apresentou níveis aumentados de 1-3 dpi e recuperou para níveis homeostáticos em 7 dpi. Os gráficos representam médias ± SEM.

Estes resultados iniciais sugerem que tanto a assinatura RevSC orientada por Yap como certos alvos WNT são expressos durante a regeneração induzida por lesão. Isto contradiz o entendimento atual, que propôs uma relação antagônica entre YAP e WNT durante a regeneração do ISC após a lesão. Para investigar ainda mais a coexpressão de marcadores RevSC e WNT em ISCs, utilizamos imuno-histoquímica (IHC) e citometria de fluxo de camundongos repórteres WNT no modelo de regeneração induzida por irradiação (Fig. 3).

Figura 3. UM) Co-expressão de WNT e Clusterin após lesão. mCherry (repórter WNT) em vermelho, Clusterin (marcador RevSC) em verde, DAPI em cinza. mCherry e Clusterin colocalizados em 1dpi, com sinais mais fortes sobrepostos em 3dpi. B) Quantificando a porcentagem de ISCs com alto WNT que são positivos para Sca1 (marcador RevSC) por citometria de fluxo. Os gráficos representam médias ± SEM. A análise estatística foi realizada por ANOVA bidirecional em (B).

Para caracterizar espacialmente células com alto WNT nas criptas que co-expressam a assinatura de células-tronco Revival (RevSC), conduzi IHC usando um sistema repórter TCF/Lef:H2B;mCherry. O repórter possui locais de ligação Tcf/Lef que impulsionam a expressão da proteína fluorescente H2B:mCherry, permitindo a visualização da sinalização WNT ativa. Observei a colocalização de mCherry e Clu (marcador RevSC) em 1dpi, que foi mais pronunciada em 3dpi (Fig. 3A). Estes resultados sugerem que os ISCs com alto WNT expressam marcadores RevSC durante a regeneração. Para quantificar com que frequência isso acontece durante a regeneração, utilizei citometria de fluxo. Ao selecionar ISCs mCherry + (ISCs de alto WNT), descobri que houve um aumento significativo na porcentagem de ISCs mCherry + expressando o marcador RevSC Sca1 em 3 dpi (~ 20%) em comparação com 0 dpi (~ 3%) (Fig3B).

Concluindo, meu projeto demonstrou que uma proporção de ISCs com alto WNT co-expressam marcadores RevSC durante a regeneração induzida por lesão. Embora preliminares, estes resultados destacam que é necessário investigar mais a fundo o papel do YAP na interação entre a sinalização WNT e a assinatura RevSC em ISCs durante a regeneração. Este trabalho forneceria clareza sobre quais sinais determinam a sobrevivência do ISC durante a regeneração.

Este projeto me proporcionou uma visão inestimável do processo científico. Aprendi técnicas avançadas no laboratório Li, incluindo cultura e manutenção organoide. Gostaria de agradecer ao meu supervisor, James, por sua orientação excepcional na construção do meu pensamento crítico, orientando meus experimentos e apoiando minha análise e interpretação de dados. Gostaria também de estender os meus agradecimentos ao Instituto Francis Crick e à Fundação de Investigação Médica Rosa Beddington Fund pelo seu generoso apoio, que me permitiu contribuir para este emocionante campo de investigação.

Afirmativo (Sem classificações ainda)
Carregando…

Related Articles

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here

Latest Articles