Você já se perguntou por que pode detectar fluorescência em sua amostra de microscopia sem cor?
Este é um fenômeno conhecido como autofluorescência.
A autofluorescência pode ser um incômodo. Reduz a relação sinal-ruído, diminuindo a sensibilidade do sinal e, em alguns casos, mascarando completamente um sinal específico.
Isso soa acquainted? Compilamos algumas dicas para otimização de ensaios para ajudá-lo a identificar e reduzir a autofluorescência em sua amostra.
O que é autofluorescência?
O termo autofluorescência refere-se a qualquer fluorescência de fundo que ocorre em células ou tecidos que não foram corados com um marcador fluorescente específico.
É causada principalmente por metabólitos e estruturas celulares que servem como fluoróforos naturais dentro da célula.
Moléculas Autofluorescentes Comuns
Nas células de mamíferos, as moléculas autofluorescentes comuns incluem:
- NADH
- Colágeno
- Elastina
- Aminoácidos aromáticos como o triptofano.
- Lipofuscinas
- flavinas
- Porfirinas e moléculas contendo porfirina
Além de muitos dos itens acima, as bactérias também contêm moléculas autofluorescentes, como:
- Clorofila
- Bacterioclorofila
- Metabólitos Secundários Pigmentados
- Proteínas da retina, como bacteriorodopsina
Nas células vegetais, a clorofila e a lignina são moléculas fluorescentes comuns.
O que é fluorescência? Um lembrete rápido
A fluorescência ocorre quando uma molécula absorve um fóton de luz, passando de seu estado de repouso para um estado excitado. Depois de alguns nanossegundos, a molécula relaxa de volta a um estado de repouso de energia mais baixa, liberando um fóton de luz de energia mais baixa em um comprimento de onda mais longo, que podemos detectar como fluorescência.
Os comprimentos de onda de excitação e emissão são específicos para cada molécula. As cadeias laterais aromáticas e as estruturas de anéis cíclicos têm maior probabilidade de apresentar fluorescência devido aos elétrons facilmente excitáveis nos sistemas de anéis conjugados.
Confira este artigo para saber mais sobre como funcionam as moléculas fluorescentes.
A autofluorescência depende do tecido
Para contextualizar isso dentro de uma célula, moléculas como o NADH, que possui um sistema de anéis conjugados, são abundantes no citoplasma. Devido aos seus anéis conjugados, o NADH absorve luz na faixa de 335–350 nm e tem um amplo pico de emissão de cerca de 440–470 nm. (1)
A fluorescência do NADH irá se sobrepor e potencialmente mascarar os sinais específicos dos fluoróforos comuns do canal verde, como Alexa Flúor 488 e FITC.
A quantidade de autofluorescência depende do tecido ou da célula. Por exemplo, o tecido cerebral de uma condição neurodegenerativa de início tardio provavelmente conterá níveis aumentados de lipofuscina, um pigmento envelhecido, que se acumula nos lisossomas das células de vida longa. (2)
A lipofuscina é autofluorescente e possui um amplo espectro de emissão que pode apresentar desafios durante a análise de amostras.
Como posso saber se minha amostra apresenta autofluorescência?
Certifique-se de incluir um controle não marcado (não fluorescente) e um controle somente de anticorpo secundário em sua amostra para identificar quaisquer contribuições de fluorescência da própria amostra e de seu procedimento de coloração.
Se sua amostra apresentar fluorescência enquanto seu controle não fluorescente permanecer escuro, sua amostra provavelmente será autofluorescente.
Para obter um guia sobre quais controles incluir em sua amostra de microscopia de fluorescência e o que eles dizem, baixe nosso guia de solução de problemas de imunofluorescência!
Também pode valer a pena executar uma varredura de comprimento de onda para ajudar a identificar os comprimentos de onda onde o sinal autofluorescente é mais forte, pois isso pode ajudá-lo na otimização do ensaio.
Então, com tudo isso dito, algo pode ser feito para reduzir a autofluorescência? Felizmente, a resposta é sim!
Opção 1: Escolha um fluoróforo supreme
A solução mais fácil é usar um fluoróforo com espectro de emissão que não se sobreponha ao espectro de emissão da molécula que causa a autofluorescência.
Por exemplo, a maior parte da autofluorescência em células de mamíferos ocorre no canal azul/verde. Portanto, o uso de um fluoróforo com espectro de emissão nas regiões vermelha e vermelha aumentará a especificidade do sinal e evitará as contribuições da autofluorescência.
Leia este artigo útil para obter um resumo das proteínas fluorescentes que você pode escolher.
Considere usar um fluoróforo mais brilhante
Dependendo da natureza do experimento, pode não ser possível usar um fluoróforo com espectro de emissão separado daquele da autofluorescência. Isto pode ser verdade em muitas situações, como em experimentos de multiplexação.
Portanto, usar um fluoróforo realmente brilhante aumentará seu sinal verdadeiro (não autofluorescente) e, portanto, aumentará a relação sinal-ruído. Em casos ambíguos em que você não tem certeza de qual é o seu sinal verdadeiro e o que é autofluorescência, o uso de um fluoróforo brilhante pode ajudá-lo a identificar o sinal desejado.
Dica: Procure fluoróforos que tenham um alto coeficiente de extinção e um rendimento quântico próximo de 1.
Opção 2: verifique sua mídia
Outra coisa a verificar é o meio em que suas células estão. Há algum composto que possa estar contribuindo para a autofluorescência?
A mídia celular geralmente contém vários suplementos como aminoácidos, carboidratos e hormônios necessários para manter o metabolismo celular.
Dois dos suplementos de mídia mais comuns são o soro fetal bovino (FBS) e o vermelho de fenol.
O FBS fornece às células os nutrientes e hormônios essenciais necessários para o crescimento celular.
O vermelho de fenol é um indicador de pH e costuma ser incluído como uma verificação rápida da saúde de uma cultura celular.
Ambos os suplementos contêm um elevado número de moléculas com cadeias laterais aromáticas e contribuirão para aumentar os níveis de fluorescência de fundo.
Reduzir a concentração de FBS e mudar para um meio como RPMI ou uma solução à base de solução salina contribuirá muito para reduzir a autofluorescência se suas células tolerarem isso.
Opção 3: Otimização da Preparação de Amostras
Reagentes fixadores contribuem para a autofluorescência. Exemplos comuns incluem:
- Glutaraldeído
- Paraformaldeído
- Formaldeído
Usar os fixadores pelo menor tempo possível ou mudar para um fixador não à base de aldeído, como etanol resfriado (usado a -20óC), ajudará a reduzir a fluorescência de fundo.
Também é importante considerar a composição biológica da sua amostra.
Por exemplo, a hemoglobina autofluoresce (devido ao anel de porfirina) em um amplo espectro de emissão e provavelmente interferiria na análise da amostra.
Se houver glóbulos vermelhos presentes na sua amostra, pode ser útil enxaguar as amostras com PBS para remover os glóbulos vermelhos e reduzir as contribuições fluorescentes dos grupos heme.
Opção 4: Tratamento Químico para Reduzir a Autofluorescência
Se você considerou as opções acima e ainda está encontrando alguma autofluorescência problemática, então tratamentos químicos podem ser necessários para atenuar o sinal de fundo.
Tratamentos com reagentes disponíveis comercialmente, como Sudan black B e borohidreto de sódio, podem ser uma opção para reduzir a autofluorescência após a fixação da amostra. (3)
Experimente Sudão Black B
Esta é uma mancha não fluorescente que extinguirá a autofluorescência de lipídios biológicos e outros tipos de moléculas dentro das células.
É particularmente eficaz na neutralização da autofluorescência de fibras elásticas, lipofuscinas e alguns outros lipídios.
Ele absorve seletivamente a luz de excitação que, de outra forma, causaria autofluorescência e, portanto, reduz a fluorescência de fundo.
Ou Borohidreto de Sódio
Este é um agente redutor que pode diminuir a autofluorescência causada pelos aldeídos formados durante a fixação das amostras, principalmente com formaldeído ou glutaraldeído.
Os aldeídos podem reagir com proteínas e outros componentes celulares para formar bases de Schiff que são fluorescentes.
O borohidreto de sódio reduz esses grupos aldeído a álcoois, reduzindo sua capacidade de fluorescência.
Se você seguir esse caminho, verifique se sua amostra pode tolerar esses produtos químicos, principalmente o borohidreto de sódio.
Opção 5: Fotodegradação
O fotobranqueamento é normalmente algo a evitar quando se trata de microscopia de fluorescência.
No entanto, no caso da autofluorescência, a fotodegradação pode ser a chave para desbloquear o sinal que você procura.
Aplicar uma luz LED de alta intensidade à sua amostra antes de adicionar os fluoróforos pode branquear a amostra e reduzir a fluorescência de fundo, aumentando o sinal gerado pelos fluoróforos escolhidos.
Opção 6: Análise Espectral Avançada
Finalmente, caso tudo mais falhe, pode ser possível otimizar seu sinal usando configurações de microscópio e software program de análise. Dê uma olhada nas opções avançadas disponíveis no software program de configuração e análise do seu microscópio.
Técnicas como mistura espectralse usado com cuidado, pode isolar o sinal autofluorescente e subtraí-lo.
Alternativamente, técnicas de imagem mais complexas, como imagem de fluorescência vitalícia (FLIM) pode valer a pena explorar se a autofluorescência ainda estiver afetando seus experimentos. O sinal do FLIM é independente da concentração do fluoróforo, o que pode resolver seus problemas. O sinal também depende do microambiente do fluoróforo e é sensível a quaisquer alterações nele.
Superando a autofluorescência em resumo
Esse foi um rápido resumo da autofluorescência, por que isso acontece e como evitá-la!
A escolha de um fluoróforo e meio de cultura ideais desde o início de seus experimentos pode economizar muito tempo na solução de problemas de autofluorescência posteriormente. Se ainda for um problema, você pode tentar alterar o fixador da amostra ou fotodegradá-la.
Se você achou este artigo útil ou tem outras estratégias para reduzir a autofluorescência, informe-nos na seção de comentários abaixo.
Referências
1. Cannon TM, Lagarto JL, Dyer BT, Garcia E, Kelly DJ, Peters NS, Lyon AR, PMW francês, Dunsby C. (2021). Caracterização das propriedades de fluorescência do NADH sob excitação de um fóton em relação à temperatura, pH e ligação à lactato desidrogenase. OSA Continuação. 4(5):1610–25
2. Moreno-García A, Kun A, Calero O, Medina M, Calero M. (2018). Uma Visão Geral do Papel da Lipofuscina na Neurodegeneração Relacionada à Idade. Neurosci frontal. 12:464
3. Baschong W, Suetterlin R, Laeng RH. (2001). Controle de autofluorescência de tecido de arquivo fixado em formaldeído e embebido em parafina em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM). J Histochem Citoquímica. 49(12):1565–72
